葫蘆耐濕澇遺傳改良方法研究進展

摘 要： 培育高耐濕澇的葫蘆品種是一項應對濕害和澇害的重要措施。根據有關文獻綜述了葫蘆科作物在耐濕澇遺傳改良方面的研究進展，主要包括葫蘆耐濕澇野生資源及其進化，基于生理的包括根的形態、保護酶活性、葉綠素含量、光合速率等主要指標與相關分子標記的葫蘆耐濕澇鑒定，加快葫蘆耐濕澇的選育進程，以及利用基因工程轉入包括活性氧清除、脅迫蛋白等在內的外源基因，提高葫蘆的耐濕澇性。并對目前葫蘆耐濕澇遺傳改良過程中存在的問題及未來的應對策略進行了探討與展望。

關鍵詞： 葫蘆； 遺傳改良； 分子標記； 生理指標； 耐澇性

葫蘆（Lagenaria siceraria）屬葫蘆科一年生草本植物。葫蘆的嫩瓜營養豐富、水分多、味清淡，具有清熱解暑等功效，而且用途廣泛，因此人們對其需求量越來越大。葫蘆最適合生長在光照充足、土壤肥力中等、排水性好、pH值 5.8～7.2、溫暖潮濕的壞境[1]，而且根系發達，吸水能力強，在前期、中期需水量較多，但在后期較少，因此在我國南方較適宜栽培。

然而我國的洪澇災害比較嚴重，約有2/3 國土存在不同程度的澇害[2]。在南方7—9月臺風天氣頻繁發生，帶來強降雨導致澇害[3]，這嚴重影響葫蘆的生長，導致產量和品質嚴重下降。多年來，科研工作者主要集中在花生、黃瓜、油菜等作物的耐濕澇研究，但在葫蘆上研究的很少。本文通過對葫蘆野生資源進化，生理指標鑒定，耐濕澇相關QTL定位和基因工程方法研究改良葫蘆耐濕澇性，以及對其在改良過程中存在的問題及未來的應對策略進行綜述，旨在促進葫蘆耐濕澇性研究的深入開展。

1 葫蘆耐澇的遺傳資源及進化

葫蘆是世界上最古老的作物之一。先民很早即以葫蘆為采食對象。伴隨原始農耕的出現， 葫蘆最早被人工馴化為栽培植物[4]。隨后人類對葫蘆的不斷選擇，使得葫蘆的品種越來越多，用途也越來越廣泛。研究表明，熱帶非洲是葫蘆最初的發源地，自從史前時代熱帶非洲僅有的葫蘆物種已經被全世界使用[5]；而且在哥倫布發現美洲之前，由于洋流的原因自發分散到全世界[6]。因此分布在熱帶非洲的葫蘆野生種或野生近緣種蘊藏著極其豐富的優良基因資源。這些野生品種在不同地理和氣候條件下生長，為了應對周圍的逆境，自身演化形成了適應當地環境的特異機制。目前，國內外已經育出許多葫蘆品種，如國內有蘋果葫蘆、新疆葫蘆、疙瘩葫蘆、佛手葫蘆、手捻葫蘆等品種；國外有小徽章葫蘆、炮彈葫蘆、土耳其頭巾葫蘆、皇冠葫蘆、香蕉葫蘆、非洲小葫蘆等品種。

早期人類對作物后代的選擇通常是無意識的，而且最后僅固定馴化了很少的性狀[7]。研究表明，葫蘆是分布范圍最廣、最普及的植物有機體[8]，它們在各個地方產生不同的適應機制。這使得葫蘆的性狀產生了不定向的進化，從而豐富了葫蘆遺傳的多樣性。由于不同地區降水量也不一樣，因而葫蘆的耐濕澇性也不一樣，這為葫蘆耐濕澇進化提供了極具價值的證據：（1）它們的生長區域跨越大范圍的氣候、生物地理和環境差異；（2）具有大量而豐富的耐澇基因組信息。因此，環境因子尤其是溫度和降水梯度能驅使這些野生葫蘆品種適應多樣的環境，從而產生更多的耐澇性不同的葫蘆品種，為葫蘆耐澇遺傳改良提供豐富的資源。

2 基于生理的葫蘆耐濕澇指標鑒定

2.1 根的形態指標

根系是植物吸收水分、養分和合成激素等代謝物質的重要器官，其發育狀況與作物抗逆密切相關，因此測定根系的形態指標可反映出植物的耐澇性。植物在適應澇害條件下，會誘發產生不定根，如Aschi-Smiti等[9]認為不定根的產生是植物在15 d的低氧環境下新陳代謝的生理適應標志。通過研究發現，淹水脅迫時在莖間容易誘發不定根，但根毛數量大幅度減少[10-13]。錢偉等[14]以葫蘆砧1號、廈門葫蘆、貴州葫蘆為砧木，研究了西瓜嫁接苗和自根苗的耐濕性，通過測定3種葫蘆砧木基部不定根數目評價了葫蘆的耐濕性。Yeboah等[15]分析黃瓜耐澇的遺傳性，以耐澇和不耐澇黃瓜為親本構建了F1、F2、F3群體，通過不定根形成、地上部分干質量為指標來比較它們的耐澇性強弱，結果表明耐澇性強的黃瓜可以通過父母品種的選育來進行選擇。濕害誘導形成的新根或不定根， 可以吸收水分和礦質養分， 皮孔增生則有助于逆境下的氣體交換排除體內毒素[16]。由此可見，植物為了適應澇害就會產生不定根，在葫蘆上可以對其根系進行有氧到低氧脅迫，再到缺氧，這個漸變的過程相當于一種缺氧鍛煉，使得葫蘆根系在結構上發生變化來適應澇害。這種適應可以使葫蘆往耐澇定向進化，使葫蘆耐澇遺傳得到改良。

2.2 滲透調節物及保護酶的生理指標

澇害可導致土壤生態系統失調， 如水分過多、氧氣偏少、土溫降低、養分流失等。目前，葫蘆科作物的耐濕澇性研究已有較多報道，其中以滲透調節物和保護酶活性為主要評價作物的耐濕澇性，從而為篩選不同耐濕澇的葫蘆科作物品種提供了鑒定指標。如張健等[17]利用葫蘆科作物南瓜和絲瓜作砧木，黃瓜為接穗，研究了在澇害脅迫下黃瓜嫁接苗和自根苗的耐澇性，通過測定根系的電解質滲出率、丙二醛（MDA）含量、超氧陰離子自由基（■）與根系SOD、POD 和CAT 細胞保護酶活性等指標，得出了絲瓜作砧木可以提高黃瓜耐澇性的結論。齊曉花等[18]以植株死亡率、葉綠素損失率、SOD 增長率、POD 損失率和CAT 增長率為耐澇指標，綜合評價了40 個黃瓜品種（系）的耐澇性，對耐澇性不同的黃瓜品種進行了分類。張英杰等[19]研究了水分脅迫下甜瓜的耐濕性，利用甜瓜幼苗的萎蔫指數、基部不定根數、電導百分率及MDA 的含量為指標，評價甜瓜品種的耐濕性強弱。Qi等[20]通過淹水，比較耐澇和不耐澇黃瓜的葉綠素、脂質過氧化物含量和POD、CAT、 SOD活性的變化，結果表明在淹水情況下，維持黃瓜正常生長和澇害中恢復主要依靠SOD和CAT的作用，而不是POD。

植物受澇害后， 首先根部缺氧，就會產生多級次生脅迫，包括還原毒物積累、離子脅迫以及氣體脅迫（CO2、乙烯、甲烷過多）等[21]，因此作物的澇害相當于一個低氧脅迫的作用。研究表明，低氧脅迫下，網紋甜瓜植株高度、根長度降低，植株鮮、干質量顯著下降，同時根系中超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）活性和丙二醛（MDA）含量也會顯著增加[22]。楊麗文等[23]研究表明，低氧脅迫處理導致甜瓜幼苗體內 ■ 產生速率和H2O2、MDA含量顯著增加，同時SOD、CAT、POD、APX、GR等抗氧化酶活性和抗氧化物質AsA、GSH含量顯著增加。方麗等[24]通過測定乙醇脫氫酶（ADH）、超氧化物歧化酶（SOD）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性和脯氨酸（Pro）含量，研究了在低氧脅迫下葫蘆砧木形態及生理特性的變化。

植株體內產生的丙二醛（MDA）可使生物膜變性，影響其正常生理代謝過程；脯氨酸（Pro）不僅可以作為植物細胞質內的滲透物質，而且還有穩定生物大分子結構、降低細胞酸性、解除氨毒以及作為能量庫調節細胞氧化還原勢等作用，從而提高植物的抗逆性；各種抗氧化酶如POD、SOD、CAT等可以保護葫蘆科作物根系免受過氧化物的傷害。不同的作物在澇害環境下產生的保護酶活性和滲透物質含量都不同，從而可以作為鑒定耐澇性強弱的指標。因此葫蘆在耐澇研究上利用其他葫蘆科作物試驗得出的生理指標為鑒定方法，在連續的耐澇試驗中加快分級篩選耐澇性不同的葫蘆品種，從而加快葫蘆耐澇遺傳改良。

2.3 葉綠素含量和光合速率的生理指標

光合作用是植物生長發育的基礎，為植物生長提供所必需的物質和能量。葉綠素是植物進行光合作用的主要色素，在光合作用中參與吸收、傳遞光能或引起原初光化學反應，在植物光能吸收、傳遞和轉化等過程中具有重要作用。研究表明，光合色素尤其是葉綠素含量的降低是導致植物光合速率降低的主要原因[25]。Xiao等[26]研究表明，小麥在淹水處理早期，它們的光合速率都快速的下降，但葉綠素含量下降的幅度很小，然而在淹水處理后期不耐澇的小麥品種光合速率下降幅度比耐澇的更大，葉綠素含量也大幅下降，解除淹水后，不耐澇的恢復得比耐澇的小麥品種快，但是光合速率和葉綠素含量的指標達不到未處理的正常水平，這為篩選耐澇的小麥品種提供了鑒定指標。隨著受澇時間的延長，根系就會缺氧而產生無氧呼吸，進而影響作物的地上部分的生長。如夏慶平等[27]研究表明，低氧脅迫導致甜瓜幼苗光合色素含量顯著下降，光合作用降低。另外Reddy等[28]以失綠狀況、葉綠素含量、葉片活性Fe2+含量和總生物量為指標，鑒定出對澇害及缺鐵癥耐性強的品系。由此可以說明通過淹水脅迫可以增強小麥的耐澇性，因此通過測定葉綠素含量和光合速率指標可以準確篩選出耐澇性不同的品種，從而縮短耐澇遺傳改良的時間。用這種方法來鑒定葫蘆耐澇性有待研究，從而加快葫蘆耐澇的遺傳改良進程。

綜上所述，在生理方面通過逐漸增加淹水量脅迫葫蘆生長，這是一個漸進的過程，前提是保證葫蘆解除水淹后能夠恢復正常生長，以根系不定根產生量、滲透調節物（可溶性糖、脯氨酸、相對電導率、丙二醛）、保護酶（過氧化物酶、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶）活性、葉綠素含量和光合速率為鑒定指標來逐步篩選耐澇的葫蘆，這樣不僅可以讓葫蘆朝著抗澇害方向進化，而且還可以加快耐澇遺傳育種改良的進程，從而定向選擇耐澇的葫蘆品種。

3 基于分子水平的葫蘆耐澇的遺傳改良

3.1 耐澇的QTL定位及遺傳

QTL指的是控制數量性狀的基因在基因組中的位置。近幾年QTL定位應用的比較廣泛，尤其是在植物抗逆性基因的定位較多，其中耐澇也是受QTL的控制。孫慧敏等[29] 研究NJRISX家系大豆苗期耐淹性的遺傳和QTL定位，利用主基因■多基因分離分析，表明該群體的耐淹性為2對連鎖主基因■多基因遺傳，主基因遺傳率為62.83%，多基因的遺傳率為8.90% 。WinQTLCart 2.5復合區間及多區間QTL定位分析均檢測到2個QTL，位于連鎖群L2上的Satt229～Satt527和Satt 527～Sat_286區間，準確定位了與耐澇性相關的QTL，同時得出了大豆的重組自交系NJRISX群體苗期耐淹性遺傳分離分析與QTL定位結果相對一致的結論，說明控制耐澇基因通過雜交遺傳到了下一代。Qiu等[30]在玉米耐澇試驗過程中，通過復合區間作圖法定位了根系長度、根系干質量、地上部分干質量、總干質量與耐澇相關的QTL，而這些指標都與玉米的耐澇性相關。李真[31]采用復合區間作圖（CIM）的逐步回歸法定位了油菜群體中與植株高度、根長度、地上部干質量、根干質量、總干質量有關的耐濕QTL共26個，其中4個QTL分布于1、15、18、20連鎖群，單個QTL的貢獻率為5.45%～ 22.89%。葫蘆在耐澇相關QTL的定位上研究很少，因此可以借鑒大豆、玉米、油菜的定位方法研究定位耐澇相關的QTL。陳嶸峰[2]利用復合區間作圖（CIM）檢測到2個與不定根形成相關的QTL，1個與葉綠素損失率相關的QTL，但是他只是對QTL進行了初步的定位，準確性不高，需要進一步研究精確定位。葫蘆與黃瓜同為葫蘆科作物，在遺傳上存在著相似性，因此在葫蘆上做耐澇相關的QTL定位有待進一步研究。

3.2 利用基因工程的遺傳改良

作物基因型間存在耐濕性差異，使得其改良有了可能。目前通過轉基因的方法獲得了許多的耐澇作物。如導入活性氧清除酶類等綜合抗逆基因，將來自煙草的Mn-OD cDNA 導入苜蓿中，轉基因苜蓿葉片受到的傷害減輕2/3以上，產量和存活率明顯提高，而煙草與苜蓿是不同科的作物，因此將來自煙草的Mn-OD cDNA導入葫蘆中產生同樣的效果也成為可能。導入編碼氧結合蛋白的專一耐濕基因，在細菌中存在著一種血紅蛋白基因VHb，將這個基因導入到煙草中，在缺氧和低氧的條件下， 轉基因煙草與對照比較，發芽時間減少一半，生長35 d 后干質量增加1倍[32]。Xu等[33]鑒定出了與黃瓜根系乙烯響應因子相關的3個基因CsERF1、CsERF2 和CsERF3；在模擬缺氧環境下，測定了CsERF1和CsERF3 的表達模式，驗證了耐低氧和耐澇性受主效基因 CsERF1控制。同樣在水稻中鑒定出耐淹澇基因標記RM219，并驗證了耐淹澇性狀由主效基因Sub1控制[34]。目前已經弄清了由缺氧誘導的ADH的基因序列結構，并在棉花等作物中得到了cDNA植株。這些基因通過轉基因導入葫蘆中，從而為選育出高耐濕澇的葫蘆品種提供了可能，但在葫蘆中能否表達需要進一步研究。

4 問題與展望

在生理鑒定指標方面，葫蘆種質資源的耐澇性鑒定是選育耐澇品種的重要基礎。目前鑒定耐澇指標有許多，一般需要測定其脯氨酸（Pro）和丙二醛（MDA）含量與過氧化物酶（POD）活性、過氧化氫酶（CAT）活性和超氧化物歧化酶（SOD）等酶的活性，但這個測定過程復雜而且費時間，最好通過形態觀察就能鑒定出是否具有耐澇性，因此迫切需要建立一套能夠在早期進行快速、準確鑒定的形態技術指標體系，從而加快育種改良進程。

在基因方面，應從澇害下植株形態結構及代謝適應性分子機制入手，應用分子標記技術尋找與葫蘆耐澇性連鎖的分子標記，精細定位與克隆相應的耐澇基因，通過分子標記、轉基因等技術高效選育耐澇品種，以促進葫蘆產業可持續發展。雖然最近幾年已經得到了與耐澇相關的基因，并導入一些作物后有明顯提高耐澇性的效果，但在葫蘆上很少研究，即使導入葫蘆中，這些基因能否正常表達也很難確定，因此在定位和克隆耐澇基因還需進一步研究，從而得到更多適合在葫蘆應用的耐澇基因。

在雜交育種方面，通過上面的綜述可以確定葫蘆耐澇的鑒定指標，這些鑒定指標縮短了篩選過程，節約了所需的時間，從而加快了育種的進程。其中將篩選出來的耐澇葫蘆品種進行隨機雜交，借助雜種優勢的效果，從中可能會獲得更耐澇的葫蘆品種。然而由于遺傳的改良會導致雜交的不親和性，因此有待研究。

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