腎衰泄濁湯對腎間質纖維化大鼠OPN、CD44的調節作用

[摘要] 目的 觀察腎衰泄濁湯對腎間質纖維化大鼠腎組織OPN、CD44的調節作用。 方法 采用單側輸尿管梗阻動物模型，將72只SD大鼠隨機分為6組。術后第7天、第14天處死，用原位雜交法檢測實驗大鼠腎組織OPN、CD44的調節作用。 結果 術后第7天、第14天，中藥各組、苯那普利組與模型對照組大鼠腎組織OPN、CD44mRNA表達較假手術組增強（P<0.01），Ⅰ、Ⅲ型膠原、FN生成增多（均P<0.05）。術后第14天，中藥各組和苯那普利組大鼠腎組織OPN、CD44 mRNA表達較模型組明顯減弱（P<0.05），Ⅰ、Ⅲ型膠原、FN生成明顯減少（P<0.05），且大鼠腎組織病理損傷明顯改善，以中藥高劑量組最為顯著，治療效果亦較貝那普利組更佳（各項指標對比（P<0.05）。 結論 腎衰泄濁湯可能是通過抑制大鼠腎組織OPN、CD44mRNA的表達，抑制Ⅰ、Ⅲ型膠原、FN等ECM的過度沉積，從而減輕腎間質纖維化。

[關鍵詞] 腎間質纖維化；腎衰泄濁湯；OPN；CD44

[中圖分類號] R285.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2013）02-25-03

腎間質纖維化（renal interstitial fibrosis，RIF）是由各種腎臟疾病發展到終末期腎病過程中出現腎損傷的共同病理特征，是最終導致慢性腎功能衰竭（chronic renal failure，CRF）的重要病理基礎。其病理特征為進行性腎間質細胞增生并產生各種炎癥介質，細胞外基質（extra cell matrix，ECM）

過度積聚于腎小管間質，尤其是Ⅰ、Ⅲ膠原和FN（fibronectin）大量沉積，致纖維組織過度增生。本研究通過采用單側輸尿管梗阻（UUO）復制腎間質纖維化模型進行動物實驗研究，觀察腎衰泄濁湯對腎組織OPN、CD44的調節作用，以探討其防治腎間質纖維化的作用機理，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物造模與分組

取SD大鼠72只（清潔級、雌雄各半），體重160～210 g，由江西中醫學院動物中心提供。動物許可證號為：SYXK

（贛）2007-0001。適應1周，尿蛋白陰性。根據體重將大鼠隨機分成6組：假手術組，模型對照組，中藥高、中、低劑量組，苯那普利組，每組12只。常規攝食、飲水，分籠飼養。

動物造模按文獻[1]方法進行，麻醉后切開大鼠左側中腹部皮膚，游離左側輸尿管，在腎盂處與輸尿管上三分之一處用四號手術線分別結扎后，切斷輸尿管，把腎置于原位，且注意手術時不能碰上腎包膜與周圍的組織，逐層縫合即制備完成。假手術組僅游離左側輸尿管，不結扎、切斷輸尿管。

1.2 藥物及試劑

腎衰泄濁湯（由生黃芪30 g，巴戟天20 g，槐花10 g，生大黃10 g，蒲公英15 g，生牡蠣30 g，丹參15 g等中藥組成），由江西省中醫院藥劑科制備而成，常規方法水煎，分別濃縮成每毫升含生藥量0.6、1.2、2.4 g三種劑量，4℃冰箱保存。貝那普利由北京諾華制藥有限公司生產，規格10 mg/片。

OPN、CD44原位雜交試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供，兔抗鼠Ⅰ型膠原抗體、兔抗鼠Ⅲ型膠原抗體、兔抗人FN抗體由武漢博士德生物工程有限公司提供，以1：100稀釋。羊抗兔IgG、DAB顯色試劑盒及L-多聚賴氨酸由福州邁新生物技術開發公司提供。

1.3 治療方法

從術后第1天開始給藥，分別按2.4、1.2、0.6 g/mL腎衰泄濁湯濃縮劑給中藥高、中、低劑量組的大鼠灌胃，即給藥劑量分別為24.0、12.0、6.0 g/（kg·d）體重灌胃（分別相當于成人劑量的20倍、10倍、5倍），貝那普利組大鼠則按苯那普利1.5 mg/（kg·d）體重灌胃（相當于成人劑量的10倍），假手術組及模型對照組大鼠按等量生理鹽水進行灌胃。各組大鼠分別于術后第7、14天各隨機選取6只處死。

1.4 腎組織學檢查

腎臟組織標本經10%甲醛的固定、脫水、浸蠟與包理、切片，做常規HE和Masson染色，并用于免疫組化及原位雜交檢測。

1.5 免疫組化檢測

ECM成分表達采用免疫組化SP法。每組取6只大鼠的術側腎臟，嚴格按試劑盒說明進行技術操作。免疫組化結果借助HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文報告分析系統（原同濟醫科大學產品）進行分析，每張切片隨機選取5個高倍視野（×400），對所選視野內的免疫組化陽性信號經計算機圖像分析，通過積分光度值反映蛋白表達的高低。

1.6 原位雜交檢測

腎組織OPN、CD44 mRNA表達：原位雜交法。每組取6只大鼠的術側腎臟，嚴格按試劑盒說明進行技術操作。原位基因雜交結果用HPIAS-1000計算機圖像的分析系統來進行計算機圖象分析。光鏡的放大倍數為20倍，然后每例隨機選取5個視野，以5個視野的平均值為每例標本的最終值，計算其單位面積平均吸光度值。

1.7 統計學處理

采用SAS6.12統計軟件進行統計學的處理。所得計量數據采用（）來表示，組間計數資料比較用方差分析，組間兩兩比較用Q檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠腎間質Ⅰ型、Ⅲ型膠原及FN蛋白表達比較

假手術組的Ⅰ、Ⅲ型膠原在腎間質部位有輕度的表達，FN在腎小球及腎小管系膜部位亦輕度表達，陽性染色顯示為棕黃色；模型對照組可見有大量Ⅰ、Ⅲ型膠原沉積在間質上，成條索狀或小片狀，著色深，腎小球系膜及基底膜亦可見陽性染色，大量FN型膠原沉積于腎小管基底膜及間質，成條索狀或融合成片，著色深。見表1。

2.2 各組大鼠腎間質OPN、CD44 mRNA表達比較

假手術組可見OPN僅在遠端小管上皮有少量的表達，而在腎小球及近端小管的表達則不明顯。模型對照組在術后第7天可見OPN在皮質受損的腎小管中（包括近端小管和遠端小管）上皮表達明顯升高，在術后14天時OPNmRNA的表達呈持續上升。假手術組可見CD44 mRNA在壁層上皮細胞與髓質小管及皮質小管有表達。見表2。

3 討論

RIF的發生機制涉及到許多細胞因子與化學因子的參與作用。近年來有研究發現，骨調素（osteopontin，OPN）是一類含有GRD（Arg-Gly-Asp）和三肽序列及凝血酶裂解

位點。其具有磷酸化與非磷酸化兩種類型的分泌性糖蛋白。它與腎巨噬細胞浸潤、腎小管間質纖維化等病理過程密切相關，是小管間質受損的標志物[2]。CD44是細胞黏附分子家族中重要成員之一，是OPN的一個配體，其通過與OPN、透明質酸（HA）相互影響，共同參與調控細胞的黏附、遷移及腎小管間質的損害。其在腎小管間質纖維化的發展過程中的近和遠端小管與集合管中的表達有升高，并和腎小管的受損及腎間質纖維化的程度有緊密的聯系[3-4]。張連云等[5]發現在腎損傷中OPN和CD44表達上調，并介導腎間質巨噬細胞浸潤和間質纖維化的發展，且相互作用參與腎臟的發病過程。

中藥腎衰泄濁湯是筆者所在醫院已經長期使用的抗慢性腎衰竭的臨床經驗方，可明顯降低慢性腎衰竭患者血清纖維化指標，保護患者腎功能[6-9]。本實驗結果顯示，模型對照組術側大鼠腎間質組織ECM（Ⅰ、Ⅲ型膠原及FN）蛋白及OPN、CD44 mRNA表達顯著高于假手術組，腎小管間質纖維化也較假手術組明顯增生，經中藥及貝那普利治療后，術側大鼠腎間質組織ECM（Ⅰ、Ⅲ型膠原及FN）蛋白及OPN、CD44 mRNA表達顯著低于模型對照組，但仍高于假手術組；腎小管間質纖維化也較模型對照組明顯改善，但仍較假手術組明顯增生。其中中藥高劑量組明顯優于貝那普利組。模型組大鼠腎間質可見ECM大量沉積，OPN、CD44 mRNA表達顯著增加，表明腎組織病理損害嚴重，出現嚴重腎間質纖維化。應用腎衰泄濁湯灌胃后，腎間質ECM沉積明顯減少，OPN、CD44 mRNA表達也顯著降低，尤以中藥高劑量組治療效果最佳。但同時也發現，本方雖可顯著降低OPN、CD44 mRNA表達量，但卻不能使ECM降解至正常，不能從根本上抑制ECM的過度沉積。

通過對本實驗結果分析發現，筆者認為腎衰泄濁湯抗纖維化的可能作用機制是：通過降低OPN、CD44 mRNA在腎小管間質中的表達，抑制小管間質炎癥細胞的浸潤、減少ECM的積聚、減輕腎小管間質的病理損傷減輕、延緩腎間質的纖維化，但其具體抗纖維化機制還有待更深入的探討。

[參考文獻]

[1] 李文歌，陳香美，師鎖柱，等.彌漫型腎間質纖維化小鼠模型的快速制備及實驗研究[J].軍醫進修學院學報，1996，17（3）：188.

[2] Xie Y，Nishi S，lguchi S，etExpression of osteopontin in gentamicin—induced acute tubular necrosis and its recovery process[J].Kidney lnt，2001，59（3）：959-974.

[3] 呂慧.原發性IgA腎病患兒腎組織免疫病理及CD44的表達[J].中國婦幼保健，2010，25（30）：4394-4396.

[4] 張良清，朱小兵，石翊颯.腎缺血再灌注損傷對大鼠腎臟CD44表達的影響[J].中國現代醫藥雜志，2010，12（10）：69-71.

[5] 張連云，和青松，楊軍，等.OPN和CD44在單側輸尿管梗阻大鼠腎臟中的表達[J].中國醫藥導報，2009，（30）：19-21.

[6] 晏子友，饒克瑯，皮持衡.中藥對慢性腎衰竭患者血清纖維化指標作用的研究[J].中國現代醫師雜志，2007，45（16）：50.

[7] 晏子友，申屠進軍，熊芳.腎衰泄濁湯對BMP-7、TGFβ-1調節作用的探討[J].中醫藥信息，2010，27（3）：34-37.

[8] 晏子友，申屠進軍，熊芳，等.腎衰泄濁湯對BMP7/TGFβ1/Smads信號通路的調節作用[J].江西中醫學院學報，2012，24（1）：21-24.

[9] 晏子友，饒克瑯，皮持衡.中藥對慢性腎衰竭患者血清纖維化指標的作用[J].中國現代醫生，2007，45（28）：50-51.

（收稿日期：2012-12-28）