B6—Co與B6小鼠眼瞼角質形成細胞的原代無血清培養及比較研究

摘要：為進一步研究B6-Co小鼠眼瞼發育缺陷機制，首次培養了小鼠眼瞼角質形成細胞，并對B6-Co和B6小鼠眼瞼角質形成細胞的遷移能力進行劃痕實驗分析，FITC-phalloidin染色比較B6-Co和B6小鼠肌動蛋白細胞骨架。結果表明，B6-Co小鼠眼瞼角質形成細胞遷移的數目和距離明顯少于B6小鼠，細胞骨架異常，B6-Co小鼠眼瞼閉合不全（EOB）是由小鼠眼瞼角質形成細胞遷移缺陷造成的。

關鍵詞：小鼠；眼瞼閉合不全（EOB）；角質形成細胞；肌動蛋白細胞骨架；無血清培養

中圖分類號：S865.1+3 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）02-0393-05

眼瞼俗稱眼皮，位于眼球前方，構成保護眼球的屏障。眼瞼分為上眼瞼和下眼瞼，直接關系到視覺功能。哺乳動物眼瞼的正常發育分為兩個階段，首先是上下眼瞼跨越角膜表面生長并逐漸相互融合，然后出生后上下眼瞼又重新分離[1]。人類遺傳性眼瞼發育異常常伴有瞼球粘連，角膜混濁，白內障，小眼球、虹膜與脈絡膜缺損，頜面部畸形，唇裂及腭裂等，嚴重者可致盲。遺傳性眼病的研究受到家系收集、遺傳異質性、表型模擬及世代間隔周期長等諸多因素限制，因此眼瞼發育缺陷的發生機制只能通過模式動物來深入系統地研究[2]。

B6-Co小鼠（C57BL/6-Corneal opacity mouse，B6-Co）是邵義祥等[3]通過ENU誘變技術獲得的一種具有角膜混濁表型的突變系小鼠，該系小鼠出生時患有眼瞼閉合不全（eyelid open at birth，EOB），EOB的發生率為43.1%，后逐步發展為角膜混濁。前期組織學研究初步證實B6-Co小鼠在眼瞼發育的14～16 d時，上下眼瞼的角質形成細胞遷移障礙。進一步研究B6-Co小鼠眼瞼發育缺陷機制以為人類眼瞼發育缺陷、角膜病的早期診斷和矯正治療提供重要的細胞模型和試驗研究手段及闡明眼瞼發育生物學機制。該研究通過對小鼠眼瞼角質形成細胞的原代無血清培養，進而探索B6-Co小鼠眼瞼角質形成細胞的遷移情況和細胞骨架形態。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 B6-Co（C57BL/6-Corneal opacity mouse，B6-Co）小鼠和B6（C57BL/6，B6）小鼠由南通大學實驗動物中心提供。小鼠飼養在清潔級屏障動物房內，室內溫度為（23±2） ℃，濕度控制為（55±5）%，自由采食和飲水，室內照明采用12 h∶12 h明暗交替，定期更換籠具、墊料。晚上9點將B6-Co（雄性）小鼠與B6（雌性）小鼠以1∶2的比例合籠交配，次日上午8點檢栓并將雌雄小鼠分籠飼養，檢測到栓的雌鼠記為孕0.5 d，并將其單獨飼養。

1.1.2 主要試劑 抗生素、大豆胰蛋白酶抑制劑及Triton X-100購自Amresco公司；角質形成細胞無血清培養基（DK-SFM）、重組人表皮生長因子（HuEGF）、0.25%胰蛋白酶-EDTA購自Gibco公司；中性蛋白酶Ⅱ及絲裂霉素C購自Roche公司； FITC-phalloidin、Hoechst 33342及霍亂毒素購自Sigma公司；24孔細胞培養板購自Corning公司；Ⅰ型膠原蛋白購自杭州生友生物技術有限公司；免疫染色封閉液購自碧云天生物技術研究所。

1.2 方法

1.2.1 B6-Co和B6小鼠眼瞼角質形成細胞的分離和原代培養 取妊娠16.5 d小鼠，體視顯微鏡下取胎鼠眼瞼，0.01 mol/L PBS清洗；將眼瞼置于含中性蛋白酶Ⅱ（3 mg/mL）和抗生素（氨芐青霉素鈉100 μg/mL、 硫酸鏈霉素100 μg/mL、硫酸慶大霉素50 μg/mL、兩性霉素B 0.25 μg/mL）的DK-SFM培養液中，4 ℃消化18 h；分離表皮，加入0.25%胰蛋白酶-EDTA，37 ℃消化約4 min；加入大豆胰蛋白酶抑制劑終止消化，1 000 r/min室溫離心5 min；棄上清，加入含有10 ng/mL EGF和10-10 mol/L的霍亂毒素的DK-SFM培養液重懸細胞；調整細胞密度為2×105 個/mL；將細胞接種于24孔板，37 ℃、5% CO2培養箱中培養；24 h時更換培養液，每2 d換液1次。

1.2.2 免疫細胞化學染色鑒定眼瞼角質形成細胞 將B6-Co和B6小鼠眼瞼角質形成細胞，每孔接種1×106個細胞，細胞長至60%～70%時，0.01 mol/L PBS輕洗；4%多聚甲醛室溫固定20 min，0.01 mol/L PBS輕洗；按照試劑盒說明書分別進行角蛋白和波形絲蛋白免疫細胞化學染色，同時用0.01 mol/L PBS作為空白對照，DAB顯色，封片，鏡檢，成像。

1.2.3 體外細胞劃痕實驗 將B6-Co和B6小鼠眼瞼角質形成細胞接種到24孔板，每孔接種1×106 個細胞，設3個重復；細胞長至80%以上時，棄原培養液，加入含有10 μg/mL絲裂霉素C的DK-SFM培養液培養12 h，然后用槍頭于孔中央進行十字劃痕；吸去培養液，0.01 mol/L PBS輕洗；加入含有10 ng/mL EGF和10-10 mol/L霍亂毒素的DK-SFM培養液，于十字劃痕附近拍照，記為0 h，每孔照3個不同的位置；培養21 h后，依據前述記錄的大致位置再次拍照并保存。

劃痕分析：用軟件測量劃痕0 h照片中三等分點劃痕的寬度，取平均值；同樣的方法測量與其對應的21 h后劃痕的寬度，取平均值；兩者之差即為細胞21 h內的遷移距離，按此方法測量每孔3個不同位置，并取它們的平均值，即為每孔的遷移距離。對0 h照片中劃痕的邊緣畫上虛線，對照21 h照片同樣畫上虛線，ImageJ軟件計數遷移細胞的數目，根據每孔3個不同位置得到的數值取平均值，即為每孔遷移的細胞數。

1.2.4 細胞劃痕實驗數據分析 實驗數據以x±s表示，經正態性檢驗后，兩組獨立樣本間均數比較采用t檢驗，每個實驗的樣本數n≥3，以P<0.05作為統計學顯著性差異的標準。

1.2.5 細胞免疫熒光染色 取劃痕8 h后的細胞用于免疫熒光染色：0.01 mol/L PBS輕洗，4%多聚甲醛4 ℃固定20 min；0.01 mol/L PBS 輕洗，5 μg/mL FITC-phalloidin 37 ℃避光孵育30 min；0.01 mol/L PBS 輕洗，0.15 μg/mL Hoechst 33342 37 ℃避光孵育5 min復染細胞核；0.01 mol/L PBS 輕洗后封片，熒光顯微鏡下觀察并記錄結果。

2 結果與分析

2.1 眼瞼角質形成細胞的形態

使用倒置顯微鏡觀察，眼瞼角質形成細胞呈典型上皮樣特征，細胞形態以橢圓形或多邊形為主，細胞排列緊密，輪廓清楚。眼瞼角質形成細胞并不以單個細胞的形式分散生長而是以單個小的克隆的形式聚集生長（圖1A），然后逐步向外延伸生長，每個小的克隆逐漸長成1個大的克隆，最后細胞以很快的速度長至合并的單層（圖1B）。

2.2 角蛋白、波形絲蛋白免疫細胞化學染色鑒定眼瞼角質形成細胞結果

B6小鼠眼瞼角質形成細胞對角蛋白抗體染色為陽性，胞漿內見棕黃色陽性顆粒（圖2A）；對波形絲蛋白抗體反應陰性無明顯著色，空白對照也無明顯著色（圖2B、2C）。B6-Co小鼠眼瞼角質形成細胞的角蛋白和波形絲蛋白的免疫化學染色結果與B6小鼠眼瞼角質形成細胞的結果一致。實驗結果表明培養的細胞為眼瞼角質形成細胞。

2.3 B6-Co和B6小鼠眼瞼角質形成細胞體外劃痕實驗結果

細胞遷移是眼瞼上皮細胞融合的關鍵，許多基因敲除小鼠具有EOB表型，研究發現是由于細胞遷移受阻，也有報道是由于表皮角質形成細胞[4]或成纖維細胞[5]遷移障礙。對B6-Co和B6小鼠眼瞼角質形成細胞進行細胞劃痕實驗檢測其遷移能力，結果顯示，劃痕21 h后B6小鼠角質形成細胞的遷移數目明顯多于B6-Co小鼠（圖3）。對角質形成細胞的遷移數目和遷移距離進行定量分析（圖4）發現B6-Co小鼠遷移的角質形成細胞數為（187±55）個，而B6小鼠為（380±60）個，差異具有統計學意義（圖4A）；細胞的遷移距離與劃痕距離的百分比，B6-Co組為25.57%±10.35%，B6組為44.93%±6.23%，兩組差異具有統計學意義（圖4B），B6-Co組細胞遷移率低于B6小鼠。結果表明，B6-Co小鼠眼瞼的角質形成細胞遷移能力降低，可能是B6-Co小鼠上下眼瞼不能融合的原因。

2.4 B6-Co小鼠眼瞼上皮細胞骨架異常

細胞定向運動與細胞骨架的動態循環密切相關，運動細胞在其偽足前沿依靠細胞骨架的不斷聚合推動細胞膜的前進，在基部靠近細胞體部位通過細胞骨架的不斷解聚收縮拖拉細胞體向前運動，細胞骨架的聚合與解聚是通過偽足與支撐表面的吸附與解吸附作用；細胞骨架，尤其是由肌動蛋白組成的微絲骨架，在細胞運動過程中扮演了非常重要的角色，肌動蛋白是真核細胞中最豐富的蛋白，也是運動細胞偽足中最主要的結構組分[6]。劃痕實驗結果表明B6-Co小鼠眼瞼角質形成細胞的遷移能力異常。對F-actin進行FITC-phalloidin染色檢測眼瞼角質形成細胞的細胞骨架見圖5。由圖5可知，野生型（wild-type，WT）小鼠眼瞼角質形成細胞邊緣肌動蛋白的分布具有極性（朝向劃痕區）且形成扁平的薄層外膜系統，即片狀偽足及位于其前面的長刺狀的絲狀偽足，而B6-Co小鼠眼瞼角質形成細胞的肌動蛋白分布不規則而且幾乎沒有絲狀偽足和片狀偽足的形成，細胞形態扁平。因此，B6-Co小鼠眼瞼角質形成細胞不能形成正常的絲狀偽足和片狀偽足，細胞的運動性受到影響。

3 小結與討論

小鼠眼瞼發育起始于妊娠11.5 d，在妊娠16.5 d時上下眼瞼融合形成閉合的眼瞼，出生后約12～14 d眼瞼重新開放。眼瞼的短暫閉合和此后的重新開放是脊椎動物眼表面形態結構發生的重要環節，眼瞼的暫時閉合可為角膜、晶狀體和視網膜的發育提供一個良好的微環境[7]。如果胚胎期小鼠眼瞼生長或融合缺陷就會導致EOB表型。有文獻報道，許多因子參與胚胎眼瞼閉合過程，這些因子包括細胞外的形態發生因子Activin βB[8，9]、TGFα[10]、HB-EGF[11]、BMP[12]、DKK2[13]和FGF10[14]，細胞表面的受體EGFR[15]和FGFR[16]，細胞內的激酶類MAP3K1[17]、ROCK I/II[18，19]和JNKs[20]，核轉錄因子c-Jun[21]、FRA-2[22]、FOXL2[23]、Grhl3[24]和SMAD[25]等。Jin等[26]在對GPR48在眼瞼發育和導致EOB表型的分子機制的研究中發現，GPR48失活的小鼠角質形成細胞增殖數目減少，絲狀偽足的形成也減少。Verdoni等[27]研究表明SRF（Serum response factor）的缺失使得小鼠皮膚角質形成細胞的分化異常，許多細胞還處于未分化狀態；細胞與細胞之間的粘著連接和緊密連接發生缺陷。借助體外培養的小鼠眼瞼角質形成細胞可以對所感興趣的因子施加干擾以研究相關因子對眼瞼發育的作用和導致EOB表型的分子機制，因而眼瞼角質形成細胞是研究EOB必不可少的細胞模型。

Miano等[28]報道細胞遷移至少經歷4個過程：首先是部分細胞的細胞膜向細胞遷移的方向彎曲形成層形足板，這一過程叫做細胞前端突出；其次是突出與基質粘著，即正在遷移的細胞前緣形成局部粘附以建立必要的基質-細胞-細胞骨架連接；再次是內部的肌動蛋白細胞骨架引發肌球蛋白活躍收縮，細胞體前移；最后是牽引細胞尾部往前。隨著肌球蛋白的收縮，細胞后半部分脫離基質按照層形足板的方向向前遷移。這些步驟都涉及胞外基質與胞內肌動蛋白細胞骨架的相互作用。肌動蛋白細胞骨架可以被認為是胞外環境與胞內信號通路的一個關鍵連接。細胞骨架是一種聚合物網絡，由3種不同的I型生物聚合物構成：肌動蛋白、微管和中間絲[29]。

細胞在遷移時首先會伸出極狀足，極狀足有兩種，一是片狀偽足，另一則是絲狀偽足，這兩種偽足可同時出現在一個細胞膜的某一局部。片狀偽足向外延伸呈波狀；絲狀偽足向外延伸呈針狀，超過片狀偽足的邊緣，作為化學或機械傳感器促使細胞遷移。該研究通過F-actin的免疫熒光染色表明B6-Co小鼠角質形成細胞的絲狀偽足和片狀偽足短且稀少，有的細胞甚至沒有，細胞骨架明顯發生異常。肌動蛋白細胞骨架異常導致了B6-Co小鼠眼瞼角質形成細胞遷移障礙，因而使得其上下眼瞼不能閉合呈現EOB表型。

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