傳統(tǒng)甜面醬中米曲霉的分離與培養(yǎng)條件優(yōu)化

摘要：采用形態(tài)學觀察對傳統(tǒng)甜面醬中分離得到的米曲霉（Aspergillus oryzae）進行了初步鑒定，并對其培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化。首先，采用單因素試驗確定米曲霉在培養(yǎng)時間56 h、濕度90%、曲料溫度30 ℃的條件下，霉菌的產(chǎn)酶能力最高；接著采用響應面試驗的Box-Behnken設計原理對單因素試驗篩選出的顯著影響因素進行三因素三水平的分析試驗，使用SAS 9.1軟件對試驗數(shù)據(jù)進行二次多項式的回歸擬合和方差分析，確定其關鍵影響因素的最終優(yōu)化值，并且預測蛋白酶和糖化酶的最高酶活。通過響應面試驗可知，當培養(yǎng)時間為54 h、曲料濕度為90%、溫度為31 ℃時，米曲霉中蛋白酶和糖化酶的酶活總和為1 764.34 U/g，與優(yōu)化前相比，酶活提高了17.33%。

關鍵詞：甜面漿；米曲霉（Aspergillus oryzae）；形態(tài)學觀察；培養(yǎng)條件；響應面試驗

中圖分類號：TS264.2+4 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）02-0408-04

傳統(tǒng)自然發(fā)酵醬的風味遠比人工保溫發(fā)酵產(chǎn)品優(yōu)良，因為變溫發(fā)酵過程有利于風味物質(zhì)的形成[1]。因此對傳統(tǒng)甜面醬種曲中的微生物進行分離、純化和鑒定，篩選優(yōu)良菌種用于工業(yè)化生產(chǎn)，對進一步提高甜面醬質(zhì)量、改善其風味具有很重要的現(xiàn)實意義。目前，甜面醬的釀制主要采用滬釀3.042，并且甜面醬中主要功能菌株為米曲霉（Aspergillus oryzae）[2]，所以，研究重點對甜面醬種曲中的米霉菌進行分離鑒定和培養(yǎng)條件的優(yōu)化，為對其進一步研究打下一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

醬樣品：于江蘇省溧陽市收集的民間醬種曲樣品。

培養(yǎng)基：菌落分離采用PDA培養(yǎng)基，菌種鑒定采用察氏培養(yǎng)基；霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基（麩皮培養(yǎng)基）為250 mL三角瓶中加入8 g麩皮、2 g豆粕、10 mL水，于121 ℃滅菌30 min，搖散。

儀器設備：LDZX-50FBS型立式蒸汽壓力滅菌鍋購自上海申安醫(yī)療器械廠，數(shù)碼照相機購自北京華旗資訊科技發(fā)展有限公司，SPX-300B生化培養(yǎng)箱購自上海躍進醫(yī)療器械廠，AIR TECH超凈工作臺購自蘇凈集團安泰公司，LHS-150SC恒溫恒濕箱購自上海齊欣科學儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種的分離與純化 在無菌條件下將曲搗碎，稱取適量樣品，選取適宜的稀釋度用生理鹽水稀釋，采用含100 U/mL青霉素的PDA培養(yǎng)基，采用稀釋涂布平板法，每個稀釋度接種3個平板，放置于30 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，進行觀察，將菌落形態(tài)不同的菌種分離，各自傳代培養(yǎng)，至少進行3次傳代分離，得到純化菌種，保存菌種備用。

1.2.2 培養(yǎng)特征的觀察 對所有分離純化的菌株劃線平板培養(yǎng)后觀察培養(yǎng)特征。

1.2.3 霉菌的鑒定 濕室培養(yǎng)法[3]：用接種環(huán)挑取少量待觀察的霉菌孢子至載玻片上，用無菌細口滴管吸取少量60 ℃培養(yǎng)基，滴加到載玻片的接種處，在培養(yǎng)基未徹底凝固之前，用無菌鑷子將皿內(nèi)蓋玻片蓋在瓊脂塊薄層上，輕壓。每皿倒入3 mL 20%的無菌甘油，使皿內(nèi)的濾紙完全濕潤以保持濕度。將制成的載玻片濕室置于30 ℃恒溫霉菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d。用無菌鑷子將長有菌體的載玻片取出，放在顯微鏡下用低倍鏡和高倍鏡觀察[4]。

1.2.4 培養(yǎng)條件的單因素優(yōu)化試驗

1）培養(yǎng)時間對產(chǎn)酶的影響。在溫度為30 ℃、曲料濕度為90%及其他培養(yǎng)條件一致的情況下，培養(yǎng)72 h，每隔8 h取樣，測定其蛋白酶和糖化酶的酶活，確定菌株的最適培養(yǎng)時間。

2）曲料濕度對產(chǎn)酶的影響。分別以70%、75%、80%、85%、90%、95%的曲料濕度，于30 ℃培養(yǎng)60 h后，測定其蛋白酶和糖化酶的酶活，確定最適產(chǎn)酶曲料濕度。

3）溫度對產(chǎn)酶的影響。在培養(yǎng)時間為60 h、曲料濕度為90%及其他培養(yǎng)條件一致的情況下，考察溫度分別為26、28、30、32、34 ℃時蛋白酶和糖化酶的酶活，確定菌株的最適產(chǎn)酶溫度。

1.2.5 響應面試驗 采用響應面試驗的Box-Behnken設計原理對單因素試驗篩選出的顯著影響因素進行三因素三水平的分析試驗[4-8]，以x1（培養(yǎng)時間）、x2（曲料濕度）、x3（溫度）3個因素為自變量，由于蛋白酶酶活與糖化酶酶活的變化趨勢相近，所以以蛋白酶和糖化酶的總酶活為響應值y，試驗因素的水平選取見表1。

使用SAS 9.1軟件對試驗數(shù)據(jù)進行二次多項式的回歸擬合和方差分析，確定其關鍵影響因素的最終優(yōu)化值，并且預測蛋白酶和糖化酶的最高酶活。

1.2.6 驗證試驗 為了確定建立的模型與試驗結果是否相符，以優(yōu)化后的最佳培養(yǎng)條件為菌株的培養(yǎng)條件進行培養(yǎng)，5次重復試驗。

2 結果與分析

2.1 醬種曲中霉菌的形態(tài)學特征

對菌落形態(tài)和顯微鏡下分生孢子頭的形態(tài)進行觀察，發(fā)現(xiàn)菌落初帶黃色，然后變?yōu)辄S綠色，老后顏色變暗。分生孢子頭疏松放射狀，呈黃綠色，孢子梗粗糙無色，初步判斷為曲霉科，屬于米曲霉（Aspergillus oryzae）（圖1）。

2.2 培養(yǎng)條件的單因素優(yōu)化試驗結果

2.2.1 培養(yǎng)時間對產(chǎn)酶的影響 米曲霉在培養(yǎng)5～9 h時處于孢子發(fā)芽期，菌絲開始生長，所以在8 h時蛋白酶酶活幾乎為零，糖化酶酶活也很低。10 h后菌絲開始大量生長，當培養(yǎng)20 h左右，米曲霉開始產(chǎn)生孢子，蛋白酶酶活大幅度上升，糖化酶酶活也上升。當曲料呈現(xiàn)淡黃色直至嫩黃綠色時，中性蛋白酶分泌最為旺盛[9]。由圖2可知，當培養(yǎng)時間為56 h左右時蛋白酶酶活達到了最大值，糖化酶酶活在培養(yǎng)時間為64 h左右時達到最大值。當培養(yǎng)時間再延長，由于曲料的含水量比較高且酶活處于下降趨勢，曲的酶活會下降得很快且容易染雜菌，導致曲的質(zhì)量下降不利于后期的發(fā)酵。因此制曲時間宜控制在56 h左右。

2.2.2 曲料濕度對產(chǎn)酶的影響 由于米曲霉的代謝作用產(chǎn)生呼吸熱和分解熱，需要通風降溫，在通風時曲料中的水分大量蒸發(fā)。當曲料的濕度在90%以上時，米曲霉才會產(chǎn)孢子。當制曲濕度偏低時，曲料中的水分大量減少，不利于米曲霉產(chǎn)孢子。質(zhì)量好的成曲要求孢子數(shù)在60億個/g（以干基計）。當濕度過大時，水容易形成水珠造成曲料的水分過大，曲料易染雜菌，且酶活易下降。由圖3可知，當制曲濕度在90%左右時，蛋白酶和糖化酶酶活最高。

2.2.3 溫度對產(chǎn)酶的影響 霉菌的最適發(fā)芽溫度為30 ℃左右，生產(chǎn)時一般控制在30～32 ℃。溫度低曲霉發(fā)芽慢，制曲的初期階段曲料的水分大，在溫度低的情況下小球菌會大量繁殖。溫度高也不適宜霉菌孢子發(fā)芽，卻適合細菌增殖；且曲霉的代謝作用產(chǎn)生呼吸熱和分解熱，熱量來不及散發(fā)，使曲料的品溫過高，易燒曲，酶活下降。由圖4可知，當制曲溫度在30 ℃左右時，霉菌的酶活最高。

2.3 響應面試驗結果

2.3.1 Box-Behnken試驗結果 根據(jù)單因素試驗結果，設計三因素三水平的Box-Behnken試驗，試驗結果見表2。

2.3.2 二次回歸擬合及方差分析 通過SAS 9.1軟件對數(shù)據(jù)進行分析，并建立二次響應面回歸模型，該模型的方差分析結果如表3所示。

以蛋白酶和糖化酶總酶活（y）為響應值，由SAS 9.1軟件擬合得到全變量二次回歸方程：y1= 1 708+60.125x1-4x2+160.375x3-379.375x12+10x1x2-100.75x1x3-302.125x22-63.5x2x3-113.875x23。

由表3可知，x3、x12、x22為顯著性影響因素，顯著性水平P<0.05，模型顯著，表明該模型具有顯著意義，且不同處理間差異顯著[10]；R2為0.936 9，說明響應值（y）的變化有93.69%來源于所選變量，即培養(yǎng)時間、濕度和溫度。因此，回歸方程能夠較好地描述各因素與響應值之間的真實關系，可以利用該回歸方程確定最佳培養(yǎng)條件。為了進一步研究相關變量之間的相互作用并確定最優(yōu)點，通過SAS 9.1軟件繪制響應面曲線圖和等高線圖，如圖5、圖6、圖7所示。

等高線圖可以較為直觀地觀察兩因素的交互作用，圓形表示兩因素交互作用不顯著，橢圓形則表示兩因素交互作用顯著。以上3圖中圖6的曲線最陡，說明x1和x3的交互作用較顯著。

經(jīng)過軟件分析，回歸模型存在極大值點。當培養(yǎng)時間為54 h、曲料濕度為90%、溫度為31 ℃時，蛋白酶和糖化酶的酶活總和最大估計值為1 766.63 U/g。

2.3.3 驗證試驗 為了驗證模型的準確性，利用優(yōu)化后的培養(yǎng)條件作為米曲霉菌株的制曲培養(yǎng)條件，重復試驗5次，5次試驗的總酶活分別為1 823.6、1 745.1、1 720.0、1 752.9和1 780.1 U/g，總酶活平均值為1764.34 U/g。

3 結論

由于不同地區(qū)的地理環(huán)境及氣候的差異，空氣中微生物菌群的種類以及比例也會有所不同，從而甜面醬種曲中霉菌的種類也有所不同。本研究篩選出的這株菌株初步鑒定為米曲霉，并通過同現(xiàn)在傳統(tǒng)所用米曲霉滬釀3.042比對酶活發(fā)現(xiàn)其糖化酶和蛋白酶酶活能力顯著優(yōu)于滬釀3.042[11]，所以對其培養(yǎng)條件進行了進一步優(yōu)化。

在單因素試驗的基礎上，結合資料確定了霉菌固態(tài)制曲培養(yǎng)條件的主要因素為培養(yǎng)時間、濕度和溫度。通過響應面分析法研究了這3個主要因素的最佳水平及其相互作用，最終確定最佳培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)時間為54 h、濕度為90%、溫度為31 ℃，此時蛋白酶和糖化酶的酶活總和最大估計值為1 766.63 U/g。優(yōu)化后總酶活為1 764.34 U/g，與優(yōu)化前相比，酶活提高了17.33%。

目前，生產(chǎn)上醬制品所用到的菌種與醬油的生產(chǎn)用菌種大致相同，但產(chǎn)業(yè)化醬制品風味比較淡薄，遠不如傳統(tǒng)醬制品風味濃郁，因此，研究傳統(tǒng)甜面醬種曲菌種，篩選優(yōu)良菌株，優(yōu)化發(fā)酵條件，并進一步產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，提高質(zhì)量穩(wěn)定性，有著非常重要的基礎研究意義。

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