苯胺降解菌的篩選及降解特性分析

摘要：采用富集培養法從污水處理廠濃縮污泥中獲得一株能夠高效降解苯胺的菌株AD-3，通過單因素試驗和正交試驗，得到苯胺降解最佳條件為溫度30 ℃、初始pH 7.0、培養時間48 h和苯胺最大耐受濃度2 500 mg/L，此時的苯胺降解率達99.7%；重金屬離子對該菌株降解苯胺有一定的抑制作用，其中Ag+和Hg2+的抑制作用較明顯。

關鍵詞：苯胺；降解菌；篩選；降解特性

中圖分類號：X172 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）02-0316-03

苯胺是染料、橡膠、塑料和制藥工業的重要原料，一些偶氮染料在環境中經微生物還原后也可形成苯胺。苯胺毒性大、難降解，可以引起人和動物溶血性貧血，中樞神經系統、心血管系統以及其他臟器的損害，對生態環境造成嚴重污染，因此苯胺是嚴重污染環境和危害人體健康的有害物質[1]。生物降解是消除環境中苯胺的一種經濟有效且無二次污染的方法。目前，國內外的學者對苯胺降解菌開展了大量的研究工作，已篩選到多種高效降解菌，如假單胞桿菌、芽孢桿菌、節桿菌等[2-4]，但仍存在著降解速度慢、處理濃度低等弊端，因此篩選能快速降解高濃度苯胺的降解菌勢在必行。該試驗以從污水處理廠的濃縮污泥中篩選出的一株能夠以苯胺為惟一碳源、氮源的高效降解菌株為研究對象，對其降解特性進行了分析，旨在為污水處理廠處理廢水及該菌的污泥培養提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 污泥來源 試驗用活性污泥取自唐山某生活污水處理廠污泥濃縮車間。

1.1.2 培養基

1）富集培養基。蛋白胨 1.0 g、葡萄糖 5.0 g、K2HPO4 1.0 g、KH2PO4 1.0 g、NaCl 5.0 g、苯胺 0.1 g、瓊脂粉20.0 g，加水至1 000 mL，pH 7.0～7.2。

2）篩選培養基。K2HPO4 0.5 g、KH2PO4 0.5 g、NaCl 0.2 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、CaCl2 0.1 g、MnSO4·H2O 0.15 g、FeCl2 0.3 g、NH4NO3 1.0 g、苯胺0.1 g，加水至1 000 mL，pH 7.0～7.2。

1.1.3 主要儀器 恒溫搖床（HQ45）：中國科學院武漢科學儀器廠；高速離心機（LG15-W） ：北京醫用離心機廠；電熱恒溫培養箱（DNP-9082）：上海精宏實驗設備有限公司；722N可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離篩選 將少量活性污泥接種于裝有富集培養基的三角瓶中，進行馴化培養，培養溫度30 ℃，搖床轉速160 r/min。將培養液按梯度稀釋分離法涂布于篩選培養基平板上，30 ℃恒溫培養48 h，待其長出單菌落后觀察菌落形態。

1.2.2 苯胺降解率的測定 用N-（1-萘基）乙二胺偶氮分光光度法繪制標準曲線，測定苯胺濃度[5]，以苯胺降解率表示菌株對苯胺的降解能力。

1.2.3 環境因素對菌株降解苯胺的影響 選取苯胺降解率最高的一株菌株AD-3用作降解菌株，分別研究溫度、pH、培養時間和苯胺濃度對苯胺降解的影響，通過正交試驗進行最佳苯胺降解條件的優化，同時探討重金屬離子對菌株降解苯胺的影響。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離和篩選結果

經劃線分離得到的苯胺高效降解菌菌株AD-3菌落為半透明、圓形、邊緣整齊、隆起或微隆起、表面光滑、淡黃色、微光澤。

2.2 苯胺標準曲線的繪制

以苯胺含量為橫坐標，以吸光度為縱坐標作標準曲線如圖1所示。當苯胺的濃度為0～40 mg/L時，標準曲線的回歸方程為■=0.026 6x-0.014 0（r2=0.999 5）。

2.3 環境因素對菌株降解苯胺的影響

2.3.1 培養溫度對菌株降解苯胺的影響 將篩選到的高效苯胺降解菌菌株AD-3接種到含有2 000 mg/L苯胺、初始pH 7.0的液體培養基中，在不同溫度（20、25、30、35和40 ℃）下振蕩培養48 h，計算苯胺降解率。由圖2可知，AD-3菌株降解苯胺的適應溫度范圍為25～35 ℃，在30 ℃時苯胺的降解率最高。

2.3.2 初始pH對菌株降解苯胺的影響 將篩選到的高效苯胺降解菌菌株AD-3接種到含有2 000 mg/L苯胺、不同初始pH（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）的液體培養基中，30 ℃振蕩培養48 h，計算苯胺降解率。由圖3可知，AD-3菌株對苯胺降解的pH范圍較窄，其最佳pH 7.0。

2.3.3 培養時間對菌株降解苯胺的影響 將篩選到的高效苯胺降解菌菌株AD-3接種到含有2 000 mg/L苯胺、初始pH 7.0的液體培養基中，在30 ℃下振蕩培養不同的時間（12、24、36、48、60、72 h），計算苯胺降解率。由圖4可知，培養時間為48 h苯胺的降解率最高。

2.3.4 苯胺濃度對菌株降解苯胺的影響 將篩選到的高效苯胺降解菌菌株AD-3接種到苯胺濃度分別為500、1 000、1 500、2 000、2 500和3 000 mg/L，初始pH 7.0的液體培養基中，30 ℃振蕩培養48 h，計算苯胺降解率。由圖5可知，當苯胺為2 500 mg/L時，苯胺的降解率達到99.2%。隨著苯胺濃度進一步提高，苯胺降解率下降，分析原因可能是高濃度的苯胺抑制菌株生長。

2.4 提高苯胺降解率的菌株培養條件優化

根據單因素試驗結果，考慮培養溫度、初始pH、培養時間和苯胺濃度對苯胺降解率的綜合影響， 按L9（34）正交表安排試驗，進行培養條件優化，各因素所取水平如表1所示，正交試驗結果見表2。從表2直觀分析可以看出，各因素對苯胺降解率的影響為A>C>B>D。由方差分析可知，溫度對苯胺降解率影響顯著，而苯胺濃度、初始pH和培養時間影響不顯著，和直觀分析結果一致。確定最佳的苯胺降解條件為培養溫度30 ℃、初始pH 7.0、培養時間48 h和苯胺濃度2 500 mg/L。在最佳苯胺降解條件下進行3次平行試驗，苯胺降解率分別為99.6%、99.9%、99.8%，苯胺平均降解率為99.7%，表明該菌株降解苯胺的效率較高。

2.5 重金屬離子對菌株降解苯胺的影響

在含有2 500 mg/L苯胺的基礎培養基中，分別添加Cu2+（1.00 mmol/L）、Ag+（0.01 mmol/L）、Hg2+（0.02 mmol/L）、Pb2+（0.50 mmol/L）4種重金屬離子，并以未添加重金屬離子的處理為對照，在相同培養條件下考查4種重金屬離子對苯胺降解率的影響。結果（圖6）表明，供試濃度的4種重金屬離子對苯胺的降解均有抑制作用，其中， Ag+抑制作用最明顯，苯胺降解率僅為30%，其次是Hg2+，再次是Pb2+，Cu2+抑制作用最小。

3 結論

研究獲得了一株高效苯胺降解菌菌株AD-3，該菌株培養條件簡單，能夠以苯胺為惟一碳源和氮源生長，通過單因素試驗和正交試驗，得到菌株降解苯胺的最佳條件為培養溫度30 ℃、初始pH 7.0、培養時間48 h和苯胺濃度2 500 mg/L，此時苯胺降解率達99.7%，表明該菌株降解苯胺的效率較高；同時探討了重金屬離子對菌株降解苯胺的影響，結果表明，4種重金屬離子對苯胺的降解均有抑制作用，其中， Ag+和 Hg2+抑制作用較明顯，其次是Pb2+，Cu2+的抑制作用最小。

參考文獻：

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