促紅細胞生成素對腦出血大鼠的神經保護作用和機制探討

[摘要] 目的 研究大鼠腦出血不同時期腦水腫、Fas相關死亡域蛋白（FADD）表達和細胞凋亡及紅細胞生成素（EPO）對其的影響，探討EPO對腦出血的神經保護作用和機制。 方法 SD雄性大鼠隨機分為假手術組、出血組、EPO治療組，采用自體血腦內注射法建立腦出血動物模型，應用免疫組化方法檢測腦出血后不同時間點血腫周邊腦組中FADD表達情況，TUNEL法檢測凋亡細胞，用干濕比重法測定腦組織含水量。 結果 與模型組比較，EPO治療組腦組織含水量明顯降低，FADD表達減少，凋亡細胞減少。 結論 EPO可以減輕腦出血后的腦水腫；EPO通過抑制FADD表達，抑制腦出血后血腫周圍神經細胞凋亡，減輕繼發性損傷，起到神經保護作用。

[關鍵詞] 促紅細胞生成素； 腦出血； 腦水腫； FADD； 細胞凋亡

[中圖分類號] R493；R743 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2013）03-0001-03

腦出血（Intracerebral hemorrhage，ICH）后血腫本身及繼發性水腫壓迫直接損害腦組織外，血腫周圍腦細胞繼發性凋亡機制也參與ICH后腦損傷。相關實驗證明促紅細胞生成素（Erythropoietin，EPO）及相應受體（EPOR）在神經組織中均有表達[1-2]。動物實驗及臨床研究均發現EPO具有神經營養和神經保護作用。Fas相關死亡域蛋白（Fas-associated with death domain protein， FADD）是死亡受體介導凋亡途徑重要的啟動子，在細胞凋亡中起到重要的作用[3]。本實驗通過觀察促紅細胞生成素對腦血腫周圍細胞FADD表達與細胞凋亡的影響，以及血腫周圍腦組織水腫影響，探討促紅細胞生成素的神經保護作用及相關機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

健康雄性SD大鼠126只，體重（250±30）g；河北聯合大學實驗動物中心提供，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。兔抗鼠FADD多克隆抗體、二抗試劑盒及TUNEL試劑盒、DAB顯色試劑盒、采購于博士德生物工程有限公司；重組人促紅細胞生成素（EPO）購自上海克隆生物高技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 腦出血模型制備 雄性SD大鼠126只，隨機分為腦出血組、腦出血EPO治療組、假手術組。每組再根據時間先后分為術后3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d共七組，每組6只大鼠。EPO治療組于術后立即腹腔注射EPO 3000 U/kg，此后每24小時腹腔注射同等劑量EPO，其余組在相應時間點注射等量的生理鹽水。模型制備：術前48 h大鼠頭部預先脫毛，術前12 h禁水及飼料，10%水合氯醛（0.035 mL/kg）腹腔麻醉大鼠。根據湯繼宏[4]等報道方法結合大鼠立體定位圖譜，在立體定位儀上，從頭部正中縱向切開皮膚，雙氧水剝蝕骨膜，于前囟前0.2 mm中線向右旁3 mm處鉆孔，同時用溫水浸泡鼠尾，消毒后斷尾取血，微量注射器抽血50 μL孔中垂直進針6 mm，均速旋轉針芯推注，整個過程時間控制在3 min內完成。推注血液后保留不動10 min后退針；骨蠟封閉骨孔，縫皮。術后大鼠可自由活動、進食。假手術組有微量注射器進針過程，不注射血液。

1.2.2 腦組織標本制作 根據實驗設計的時間點用水合氯醛（0.04 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠，開胸暴露心臟及主動脈，用磨鈍12號針頭從左心室插入直至主動脈，刀片劃破右心房。用注射器將37℃生理鹽水慢速注入體循環，約200 mL后右心房流出的液體無色，換用4%多聚甲醛磷酸緩沖液250 mL灌流5 min直至大鼠尾巴及四肢僵硬。開顱取出血側針孔前出血灶周圍約100 mg進行腦組織含水量測定，余大腦置于4%多聚甲醛后固定24 h以上，取標本針孔后約2 mm腦組織，制成切片備用。

1.2.3 FADD免疫組織化學染色方法 ①腦組織切片逐步梯度脫蠟至水。②置3%H2O2液體20 min。③高溫修復抗原。④封閉液30 min，PBS洗滌，兔抗鼠FADD多克隆抗體37℃濕盒反應1 h，PBS洗滌。⑤滴加二抗，37℃濕盒孵育1 h，PBS洗滌。⑥過氧化物酶溶液37℃反應30 min，滴加DAB劑覆蓋組織，室溫避光顯色3～5 min至顯色，水洗終止反應。⑦蘇木素復染，水洗終止反應，充分藍化30 min。樹膠封片。

1.2.4 細胞凋亡檢測步驟 ①標本切片脫蠟至水；②置配制的3%H2O2溶液于室溫20 min；③標本片加0.01M TBS 1：200新鮮稀釋Proteinase K 37℃消化1～15 min；④TdT和DIG-d-UTP各1 μL，加入18 μL標記緩沖液中，滴在樣品上置于濕盒中，37℃標記2 h。⑤加封閉液50 μL/片，室溫30 min；⑥抗體稀釋液1∶100 稀釋生物素化抗地高辛抗體；⑦抗體稀釋液1∶100 稀釋SABC，37℃反應30 min；⑧DAB 顯色，蘇木素輕度復染、中性樹膠封片。

1.2.5 免疫組化結果 高倍鏡下細胞漿呈棕黃色為FADD陽性細胞，無染色為陰性。高倍鏡下（×400）取5個視野，分別計數后取平均數值。

1.2.6 凋亡結果判斷 凋亡細胞為細胞核中有棕黃色顆粒者，高倍鏡下（×400）隨機選取5個不重疊的視野，分別計數后取平均數值。

1.2.7 腦組織含水量檢測 取EP預先編號置于105℃恒溫烤箱內烘烤48 h，稱重記錄，用濾紙吸標本表面腦脊液及殘余血液置于EP管中，電子天平快速稱重，減去EP管重就是腦組織濕重。EP管置105℃烤箱內48 h后，3次稱重取其平均值，減去EP管重就是腦組織干重。含水量（%）=（腦組織濕重-腦組織干重）/腦組織濕重×100%。

1.3 統計學分析

應用SAS8.2統計軟件進行統計學處理，計量資料以均數±標準差表示，多組計量數據比較采用方差檢驗。

2 結果

2.1 FADD檢測結果

見表1。FADD多見于細胞漿，細胞膜少量表達。腦血腫邊緣FADD陽性細胞表達增多。腦出血模型組FADD陽性細胞在出血3 h開始增多，出血后6～72 h明顯增多（P <0.05）。EPO治療后顯著降低血腫周圍FADD陽性細胞數，EPO治療組6～72 h FADD陽性細胞顯著減少（P < 0.05）。

2.2 EPO對大鼠ICH凋亡細胞的影響

見表2。假手術組見極少凋亡細胞。EPO能明顯降低細胞凋亡數，與腦出血模型組比較，EPO組24 h～7 d凋亡細胞明顯減少（P < 0.05）。

2.3 EPO對大鼠ICH腦水腫的影響

見表3。

3 討論

促紅細胞生成素（EPO）是一種糖蛋白激素，分子量為34KD，由165個氨基酸組成。近年來大量實驗研究表明，腦組織中有EPO和EPOR的表達，同時發現EPO的生成量與腦組織的供血供氧密切相關，當腦組織缺血缺氧時，EPO的生成量成倍增加，并對神經元起到一定保護作用。Brines[5]等利用生物素標記的EPO進行動物實驗，靜脈注射5 h后，可觀察到生物素標記的EPO存在于微血管周圍并且進入腦實質，證明EPO可透過血腦屏障。

腦出血后繼發性的腦水腫加重了神經元的損害。本試驗發現腦出血后12～72 h腦水腫處于高峰期，EPO治療組腦水腫較出血組有明顯的減輕，與王鳳英[6]等研究結果大致相同，可能和EPO保護血腦屏障完整性[7]，緩解動脈痙攣和降低神經細胞壞死的數量[8，9]，促進新生血管生成和側支循環的建立有關[10，11]。

研究證實，EPO在多種神經細胞損傷模型中均有抗凋亡作用[12，13]。在PC12細胞內，EPO生成增多能增強抗凋亡基因Bcl-XL的表達，同時降低促凋亡基因Bak的表達。在小膠質細胞的培養過程中發現EPO能改變Bcl-2/Bax的比率[14]起到抗凋亡的作用。FADD是一種死亡域蛋白，又名Mort1，能與Fas胞漿區形成特異性結合，故命名Fas相關死亡域蛋白（Fas-associat-ed withdeath domain protein）。FADD與Fas的死亡域相互作用后，將caspase-8募集于Fas信號復合體，激活半胱氨酸蛋白酶級聯反應導致細胞凋亡。本研究發現腦出血后3 h腦血腫周圍腦組織中FADD陽性細胞開始出現少量表達，24～48 h達到高峰，相應的凋亡細胞數在3 h增加，24～72 h凋亡細胞數達到高峰。EPO治療后能明顯抑制FADD的表達，從而達到減少細胞凋亡，這與胡躍強[15]研究結果大致相同。本研究結果證實EPO對出血性腦損傷具有腦保護作用，可減輕腦水腫，減少細胞凋亡。

本研究揭示了在EPO能抑制腦出血后細胞凋亡及繼發性腦水腫，證實EPO的神經保護作用，為今后在臨床應用EPO治療腦出血提供實驗依據。

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（收稿日期：2012-12-04）