代謝組學運動選材與傳統生化選材方法的比較

摘要：通過與傳統生化選材方法進行對比，探索代謝組學這一新興的系統生物學方法用于運動選材的可行性與優越性。將雄性SD大鼠24只，在幼年時（4周齡）即收集其尿樣和血樣，尿樣用于核磁共振（NMR）代謝組學分析，血樣用于測試血紅蛋白（Hb）和血清睪酮（ST）；然后開始漸增負荷游泳訓練直至成年（14周齡），訓練結束后進行負重耐力游泳能力測試，記錄每只大鼠游泳至力竭的時間，并根據力竭時間長短進行排名，分為前3名組與4～24名組、前12名組與后12名組共4組；測試完成后，休息2 d，斷頭處死，取右后肢腓腸肌測試琥珀酸脫氫酶（SDH）和乳酸脫氫酶（LDH）。結果顯示：無論是前3名組與4～24名組之間，還是前12名組與后12名組之間，Hb、ST、SDH和LDH指標均較為接近，并且相互交錯，組間沒有顯著性差異；而大鼠的代謝特征圖譜有明顯的差異，不同組樣本被明確地分開了，而同組的樣本則出現了聚集。結果表明：大鼠幼年時的代謝特征圖譜能一定程度反映它們成年后游泳能力的差異，相對于利用一個或者少數幾個指標進行運動選材的傳統生化方法，代謝組學這一系統生物學方法具獨特的優勢。

關 鍵 詞：運動生物化學；代謝組學；運動選材；核磁共振；模式識別；游泳；大鼠

中圖分類號：G804.7 文獻標志碼：A 文章編號：1006-7116（2013）01-0123-06

在還原論（不斷地向微觀世界深入）的指導下，人類對生命現象的研究已經取得了大量的成果，甚至在細胞和分子水平對生物體都有了很具體的了解，運動選材也早已從最初的身體形態觀察、身體素質測試，發展到生理、生化指標，甚至運動相關基因的研究。據報道，血紅蛋白（Hb）、血清睪酮（ST）、琥珀酸脫氫酶（SDH）和乳酸脫氫酶（LDH）與運動能力密切相關，并且遺傳度也相對較高，是傳統運動生化選材的常用指標[1]。然而，還原論的基本思路是將生物體拆分為一個比一個更小的零件，研究單個組成元素或者說個別生物學指標與生命現象的關系，所以其研究結果往往難以對生物體整體的行為給出系統、圓滿的解釋[2]。因此，在后基因時代，以系統整體為研究對象，以基因組學、蛋白質組學和代謝組學為代表的系統生物學已日漸成為生命科學研究的趨勢[3]。代謝組學通過測量樣本中所有的代謝產物來反映生物體對不同刺激的反應[4]，利用代謝特征圖譜對生命系統進行研究[5]。相對于基因層面的研究，代謝組學具有靈敏性更高、整體性更強，測試與分析簡單、快速等優點[6-7]。此前的研究已初步證明了運動員的代謝特征圖譜包含了運動員競技水平的信息[8]，并建立了高水平男子中短距離游泳成績預測代謝組學模型[9]。本研究以SD大鼠為研究對象，探索能否利用大鼠幼年時（4周齡）的代謝特征圖譜，識別出游泳潛力較大的大鼠，即經過長期訓練后，在成年時（14周齡），能取得優秀游泳成績的大鼠；并通過與傳統生化方法進行對比，對基于核磁共振（NMR）的代謝組學這一系統生物學方法應用于運動選材的可行性與優越性進行分析。

1 實驗對象與方法

1.1 實驗對象

3周齡健康雄性SD大鼠24只，由南昌大學實驗動物科學部提供，清潔級實驗動物。平均體重（207.1±43.9） g，采用國家標準大鼠飼料分籠喂養（飼料由南昌大學實驗動物科學部提供），自由飲食，室溫20～24℃，自然光照。

1.2 訓練開始前收集尿樣與血樣

1周適應性游泳結束后，正式訓練開始前，即于大鼠4周齡時（幼年期），收集大鼠的尿樣與血樣：用代謝籠采集24 h尿液，加入適量疊氮鈉（NaN3）防腐，然后EP管密封，保存于-80 ℃冰箱待一維核磁共振氫譜（1H NMR）測試；尿樣采集完后，取尾血約1 mL，保存至抗凝管內，待檢測Hb和ST。

1.3 訓練與分組

1）訓練方法。

尿樣收集完后第2天，開始正式游泳訓練。游泳池水深60 cm，水溫25～30 ℃。訓練采用負重方式，時間為10周，每周訓練5 d，每天1次，每次訓練持續時間以大鼠個體是否出現疲勞為準。負重量：正式訓練第1周負重量為大鼠平均體重的2%，以后每2周在原有基礎上增加1%，一直增加至大鼠平均體重的5%為止。疲勞標準：大鼠鼻尖2次沉于水中5 s以上，判斷為疲勞[10]，出現疲勞的大鼠停止訓練，并及時撈出避免溺水。

2）游泳能力測試與分組。

10周負重游泳訓練結束后，休息24 h，即在大鼠14周齡時（成年期），進行游泳能力測試。負重量約為平均體重的5%，入水開始計時，游至力竭停止計時。力竭標準：大鼠水中旋轉、運動協調性明顯下降、水淹沒鼻尖、身體下沉至水面超過10 s[11]。根據游泳至力竭時間長短進行排名，將24只大鼠分為前3名組與4～24名組、前12名組與后12名組。

1.4 訓練與測試完后收集肌肉樣本

大鼠游泳能力測試結束48 h后，斷頭處死大鼠，取右后肢腓腸肌一小塊，錫紙包裹，即刻放入液氮中保存。

1.5 傳統生化指標測試

1）血紅蛋白（Hb）與血清睪酮（ST）。

Hb測試采用氰化高鐵血紅蛋白試劑盒（購自南京建成生物工程研究所）。測試時取試劑5 mL，加采集的大鼠尾部全血20 μL，回洗3次，混勻后靜置5 min，空白管調零，540 nm波長比色。

ST測試采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附法（ELISA），試劑盒由南京建成生物工程研究所代購，按說明書要求步驟進行操作。

2）琥珀酸脫氫酶（SDH）和乳酸脫氫酶（LDH）。

取保存于液氮中的肌肉組織1 g，冰冷的生理鹽水中漂洗，眼科小剪剪碎，手動玻璃勻漿器勻漿（在冰水浴中進行），低溫離心機2 000 r/min離心15 min，取上清液。然后利用琥珀酸脫氫酶（SDH）與乳酸脫氫酶（LDH）測試試劑盒（購自南京建成生物工程研究所），嚴格按照說明書進行檢測。

1.6 1H NMR測試

尿樣于室溫下解凍，每個尿液樣品取400 L，加入200 L磷酸緩沖液（0.3 mol/L，pH7.4），質量分數10%重水（D2O，鎖場）和0.05%TSP（內標）。靜置10 min，再于4 ℃，13 000 g離心10 min，取上清液5 mm核磁管進行1H NMR測量，磁場共振頻率400.13 MHz，譜寬16.02，掃描32次，溫度30 ℃，預飽和方式壓水峰，脈沖序列NOESYPR1D。

1.7 基于NMR的代謝組學分析

基于NMR的代謝組學研究通常以尿液作為研究對象，利用1H NMR產生數據。氫原子在不同分子中的化學環境不同，在1H NMR中顯示出不同的吸收峰，其中峰的數量就是氫的化學環境的數量，而峰的強度（也稱為面積），就對應處于某種化學環境中的氫原子的數量。由于尿液1H NMR完整地反映了哺乳動物個體獨特的代謝表型與代謝特征，被稱為“代謝特征圖譜”。簡而言之，代謝組學研究的不再是一個或幾個代謝指標，它研究的是整個生物體所有代謝產物形成的“代謝特征圖譜”變化與差異，尿液1H NMR上不同的譜峰代表了尿液中不同的代謝物，譜峰的面積則反映了該代謝物的相對濃度；哺乳動物的代謝產物基本上都包含氫，而NMR是目前唯一既能定性，又能在微摩爾范圍對所有含氫代謝物同時進行定量分析的技術[6]。

1）譜圖處理與產生數據。

利用軟件MestReC4.9.9.6對所測得的1H NMR進行手動相位和基線校正，以TSP共振峰為參考調零。然后對10～0.04進行分段積分，每段0.04，為了消除核磁共振采集信號過程中壓水峰所造成的影響，去除了水峰和尿素峰附近6.2～4.4這一區段。在模式識別和進行數理統計與分析前，每段的積分數據相對于每張氫譜的總積分進行標準化處理[9]。

2）模式識別。

哺乳動物尿液中的代謝物組成復雜，眾多的小分子代謝物通常會在1H NMR產生成千上萬的共振峰[8]，要想解讀實驗對象代謝特征圖譜的差異或變化，就必須借助以計算機信息技術為基礎發展起來的模式識別技術[9]。偏最小二乘法（PLS）是一種集多元線性回歸法和主成分分析（PCA）的基本功能于一體的、對高維度數據具有強大處理能力的模式識別方法[12]。本研究采用SIMCA-P 10.0軟件包（瑞典，UmetricsAB，Umea）進行PLS模式識別和自變量因子（各觀測指標）重要性程度分析。

1.8 統計學分析

各數據以均值±標準差（ ±s）表示，均數比較使用SPSS15.0 （SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）進行T檢驗，顯著性水平為α=0.05，非常顯著性水平為α=0.01。

2 結果與分析

2.1 游泳測試成績

24只大鼠經過10周漸增負荷游泳訓練后，游泳能力測試顯示：前3名組大鼠游泳至力竭的平均時間為（118.00±56.18） min，4～24名組大鼠力竭的平均時間為（28.97±10.64） min，兩組比較，差異具有非常顯著性意義（P﹤0.01）；前12名組大鼠力竭的平均時間為（58.39±43.60） min，后12名組大鼠力竭的平均時間（為21.82±6.39） min，兩組比較，差異具有非常顯著性意義（P﹤0.01）。

2.2 傳統生化指標測試

如表1所示，前3名組和前12名組大鼠的Hb分別為（152.3±9.5） g·L-1和（153.72±21.72） g·L-1，略低于4～24名組和后12名組的（165.73±74.42） g·L-1和（174.39±65.76） g·L-1，并且組間數據彼此交錯，差異不明顯，無顯著性意義（P＞0.05）；ST、SDH以及LDH的測試結果與Hb類似，也是前3名組和前12名組大鼠分別略低于4～24名組和后12名組，組間數據彼此交錯，差異不明顯，無顯著性意義（P＞0.05）。

2.3 代謝組學

1）模式識別結果。

PLS模式識別結果如圖1、圖2所示，在以第1主成分（t1）為橫坐標，第2主成分（t2）為縱坐標的散點圖上，前3名組和4～24名組樣本、前12名組和后12名組樣本被明確地分開了，而同組的樣本則各自聚集。這一結果表明，游泳潛力不同的大鼠，其幼年時（4周齡）的代謝特征圖譜（1H NMR）就具有明顯的差異，利用基于NMR的代謝組學方法結合模式識別技術，將先天條件優越、成年后能取得較好游泳成績的SD大鼠（如圖1中的前3名或前12名）從小選拔出來具有一定的可行性。

2）1H NMR譜峰重要性分析與代謝標志物的發現。

根據整個代謝特征圖譜的特征和差異來研究生命現象是代謝組學的主要手段。尿液1H NMR譜是由成千上萬的、代表著不同代謝物的共振峰組成，這些共振峰在模式識別中的重要性也不相同。如圖1、圖2所示，根據大鼠1H NMR譜的特征和差異，前3名組和4～24名組樣本、前12名組和后12名組樣本被明確地分開了，而同組的樣本則實現了聚集。那么哪些代謝物的共振峰在模式識別過程中起到了主要作用呢？PLS在進行模式識別的同時，還能對不同譜峰的重要性進行分析。不同代謝物共振峰的重要性可以用變量投影重要性指標 （VIP）來量化[12]，據此可以發現在模式識別過程中起到了主要作用的代謝物。

本研究中，VIP值較高的、能較大程度反映大鼠游泳潛力的1H NMR譜各區段及譜峰歸屬（圖3）結果如表2所示。統計結果顯示，前12名組在7.88～7.84、7.56～7.52和7.64～7.60 3個區段的相對積分值明顯高于后12名組，而在3.96～3.92、3.08～3.04和2.28～2.24 3個區段的相對積分值則明顯低于后12名組，差異均具有顯著性意義或非常顯著性意義。前3名組與4～24名組之間的數據比較結果與此一致，但由于前3名組樣本數太少（3個），差異未出現顯著性意義。

3 討論

3.1 大鼠年齡、游泳訓練與測試

大鼠的壽命一般為2.5～3.0年，2個月左右性成熟。4周齡大鼠相當于人類青春期前的小孩，本研究稱為幼年期；經過10周訓練后，大鼠為14周齡（約3個半月），相當于人類的青壯年時期，也正是運動員出成績的時候，本研究稱為成年期。為了保證研究結果適用于運動員早期選材和避免運動訓練對結果的影響，本研究的代謝特征圖譜以及Hb和ST測試均在大鼠幼年期、游泳訓練未正式開始之前進行；而游泳能力測試則在10周游泳訓練后進行，此時的測試成績反映的是大鼠經過訓練后，在成年期所能達到的游泳水平。

大鼠游泳訓練與測試主要分為耐力型、速度型和迷宮型3類，由于操作相對簡單，耐力型是實驗室研究采用得最多的一種模式[13]。這種模式一般采用“負重”游泳的方式來增加訓練量，測試游泳至力竭的時間來評價大鼠的游泳能力[13]。本研究采用的也是漸增負荷的耐力性游泳訓練。經過10周訓練后，從測試的結果來看，訓練達到了預定目的。大鼠的游泳能力出現了明顯的差異：前3名大鼠游泳至力竭的平均時間為（118.00±56.18） min，比4～24名大鼠力竭時間的4倍還多；前12名大鼠力竭的平均時間為（58.39±43.60） min，也超過了后12名大鼠力竭時間的2倍。

3.2 基于NMR的代謝組學運用于運動選材的優越性

傳統生化選材研究往往專注于運動能力與某個或少數幾個生化指標的關系，然而生物體并不是單個構成元素或者構成部件的簡單相加，單個生化指標很難準確反映運動員的運動能力與運動潛力[14]。雖然許多報道已經證明，作為常用傳統生化選材指標，Hb與運動員氧運輸能力、ST與運動員身體素質發展密切相關[15-16]，SDH和LDH是運動員能量代謝的關鍵酶[1]，但是從本實驗的結果來看：游泳潛力較好的大鼠（前3名組和前12名組）幼年時的Hb與ST的水平與其它大鼠相比并沒有明顯的差異（P＞0.05），單純從數值上來看，甚至還略低于4～24名組和后12名組；SDH和LDH的測試結果也與此基本一致，沒有發現游泳能力不同的大鼠之間有顯著性差異（P＞0.05）。可見，這些傳統生化選材指標對預測運動員運動能力的作用都相當有限，因為這些指標所反映的只是整個生物體非常局部的、某個組成元素或部件的差異，而決定運動員運動表現的是整體。

研究表明，不同基因系人群的代謝特征圖譜具有明顯的差異[17-18]，基因層面微小的差異，都可能會引起代謝產物的劇烈變化[7，19]。另外，機體的許多生命活動是發生在代謝物層面的，如細胞信號釋放、能量傳遞、細胞間通信等都是受代謝物調控的[20]，這些活動可能與運動能力或運動潛力直接相關，而基因層面的研究卻反映不了這些活動。

從本實驗的結果來看，經過PLS模式識別，前3名組和4～24名組樣本（圖1）、前12名組和后12名組樣本（圖2）被明確地分開了，而同組的樣本則各自聚集。這一結果表明，游泳潛力不同的大鼠，其幼年時的代謝特征圖譜（1H NMR）就具有明顯的差異，利用基于NMR的代謝組學方法結合模式識別技術把先天條件優越、適合從事耐力性游泳項目的SD大鼠從小選拔出來具有可行性。

3.3 代謝標志物與運動選材的關系

由于每段1H NMR譜相對積分值在一定程度上反映該區段主要物質的相對濃度，因此從圖3和表2的結果可以看出：游泳潛力較大的大鼠尿液中馬尿酸的相對含量較高，而游泳潛力較差大鼠的則肌酸、肌酸酐和乙酰乙酸的相對含量較高。

1）馬尿酸。

馬尿酸在肝臟中由線粒體合成，它的合成依賴于線粒體氧化磷酸化提供三磷酸腺苷（ATP）的能力[21]，因此尿液中馬尿酸的含量反映了肝細胞的能量代謝狀態。研究表明，任何肝臟能量代謝的障礙均可影響馬尿酸的合成能力，導致尿液中馬尿酸水平的下降[22-23]。由于肝臟的生理功能均以能量代謝為基礎，臨床上，馬尿酸檢驗是肝功能測試指標之一。

肝臟是人體內臟里最大的、也是新陳代謝最重要的器官，幾乎參與了體內所有的代謝過程。人類心臟有力和有規律的跳動、吃的食物能夠完全被消化和吸收、大小腦能夠保持正常的功能、肌肉能夠保持結實和富有彈性，都離不開肝臟的作用[24]。本研究中，游泳潛力較大的大鼠在4周齡時就表現出尿液中馬尿酸相對含量較高的特征，這可能反映了它們的肝臟機能天生就相對較強，這也可能是它們通過10周游泳訓練后能取得較好成績的一個關鍵因素。因為運動時，機體的能量供應嚴重依賴肝臟，例如，運動的中后期，內源性的葡萄糖幾乎就完全來自肝糖原分解或糖異生作用。

2）肌酸和肌酸酐。

人體內的肌酸，部分來自于食物，部分在體內肝臟合成，體內肌酸形成后，大部分被骨骼肌細胞攝取，并以磷酸肌酸的形式儲存能量，它的主要生化效應是把線粒體中的能量以磷酸肌酸的形式送到肌原纖維處，以迅速補充ATP的含量，滿足運動的需要[25]。肌酸在運動中的應用已經相當普遍，研究表明，補充肌酸能縮短運動員肌肉恢復的時間，對于需要提高肌肉爆發力，或需要增加肌肉體積的運動員，服用肌酸也可以有良好的效果[25]。肌酸酐簡稱肌酐，是肌酸和磷酸肌酸分解代謝的終產物，由肌酸脫水或磷酸肌酸去磷酸化、脫水生成，最后經尿排出[26]。當肌肉發生病變時，肌酸攝取減少，從尿中排出增加，所以醫學上，尿肌酸是肌炎和皮肌炎的診斷指標之一[27]。正常生理條件下，尿液中肌酸與肌酐相對含量較高，可能反映了肌細胞攝取或利用肌酸的能力相對較差，導致體內肌酸以尿肌酸和尿肌酐的形式流失。本研究中，游泳成績較差的大鼠在4周齡時就檢測到尿液中肌酸和肌酐的相對含量較高，這可能對它們后期肌肉的發育以及訓練效果產生重大影響，導致它們在競爭中處于下風。

3）乙酰乙酸。

乙酰乙酸是脂肪酸不完全氧化的中間產物，是酮體的一種，尿乙酰乙酸是臨床檢查尿酮體的主要方法。尿乙酰乙酸含量增加，說明機體糖類物質供能不足，脂類物質代謝增高。本研究中，游泳成績較好的大鼠在4周齡時就被檢測出尿液中乙酰乙酸相對含量較低，這可能反映了它們利用糖類物質為機體供應能量的能力較強，因而脂類物質參與供能較少。在大部分競技運動項目中，糖類物質的儲備及利用效率是運動員取得優秀成績的決定性因素，因為3大能源物質中，糖是唯一的既能進行有氧氧化、又能進行無氧氧化的物質，即使同樣是有氧氧化，糖氧化供能的效率也比脂肪和蛋白質高得多。

參考文獻：

[1] 王金燦. 運動選材原理與方法[M]. 北京：人民體育出版社，2005.

[2] 孫蘭芳，姜璐. 系統生物學：系統科學與生物體系統[J]. 系統工程理論與實踐，2005，10：67-72.

[3] 楊勝利. 21世紀的生物學——系統生物學[J]. 生命科學儀器，2004（2）：5-6.

[4] Bertram H C，Hoppe C，Petersen B O，et al. An NMR-based metabonomic investigation on effects of milk and meat protein diets given to 8-year-old boys[J]. Br J Nutr，2007，97（4）：758-763.

[5] Jonsson P，Johansson A I，Gullberg J，et al. High-throughput data analysis for detecting and identifying differences between samples in GC/MS-based metabolomic analyses[J]. Anal Chem，2005，77（17）：5635-5642.

[6] 劉樹業，段櫻，李嫻. 代謝組學的進展及肝臟代謝組學[J]. 分子診斷與治療雜志，2009（3）：197-202.

[7] Lu P，Rangan A，Chan S Y，et al. Global metabolic changes following loss of a feedback loop reveal dynamic steady states of the yeast metabolome[J]. Metab Eng，2007，9（1）：8-20.

[8] 李江華，劉承宜，徐曉陽，等. 2006多哈亞運會短距離游泳男運動員代謝組學研究[J]. 體育科學，2008，28（2）：42-46.

[9] 李江華，劉承宜，沙海燕，等. 高水平男子中短距離游泳成績預測代謝組學模型[J]. 體育學刊，2010，17（4）：103-106.

[10] 劉剛，張纓，馮美云，等. 1，6一二磷酸果糖對疲勞性游泳大鼠自由基和血尿酸、血肌酐代謝的影響[J]. 北京體育大學學報，1998，21（2）：8-10.

[11] Thomas D P，Marshall K I. Effects of repeated exhaustive exercise on myocardial subcellular membrane structures[J]. Int J Sports Med，1988，9（4）：257-260.

[12] 李江華，范葉飛，劉文鋒. 偏最小二乘法在體育科研中的應用與實踐[J]. 中國體育科技，2010，46（6）：138-141.

[13] Dawson C A，Horvath S M. Swimming in small laboratory animals[J]. Med Sci Sports，1970，2（2）：51-78.

[14] Abbott A，Button C，Pepping G J，et al. Unnatural selection： talent identification and development in sport[J]. Nonlinear Dynamics Psychol Life Sci，2005，9（1）：61-88.

[15] 龐毓恩，屈紅林. 試論運動選材的遺傳因素與方法[J]. 安慶師范學院學報：自然科學版，2005，13（3）：112-115.

[16] 郭蕾. 藝術體操運動員科學化選材中生理生化指標的應用[J]. 西安文理學院學報：自然科學版，2009，12（2）：115-118.

[17] Lenz E M，Bright J，Wilson I D，et al. Metabonomics，dietary influences and cultural differences：a 1H NMR-based study of urine samples obtained from healthy British and Swedish subjects[J]. J Pharm Biomed Anal，2004，36（4）：841-849.

[18] Kochhar S，Jacobs D M，Ramadan Z，et al. Probing gender-specific metabolism differences in humans by nuclear magnetic resonance-based metabonomics[J]. Anal Biochem，2006，352（2）：274.

[19] Li M，Wang B，Zhang M，et al. Symbiotic gut microbes modulate human metabolic phenotypes[J]. PNAS，2008，105（6）：2117-2122.

[20] 陳慧梅. 代謝組學及其研究方法和應用[J]. 腎臟病與透析腎移植雜志，2005，14（1）：59-64.

[21] Aoyama H，Kamiyama Y，Ukikusa M，et al. Clinieal significance of hippurate-synthesizing capacity in surgical patients with liver disease：a metabolic tolerance test[J]. J Lab Clin Med，1986，108（5）：456-460.

[22] 王偉明，黃育華，熊振芳，等. 肝氣郁結證大鼠尿液代謝組學研究[J]. 中西醫結合肝病雜志，2010，20（2）：102-105.

[23] 郭永征. 經ALSS治療的乙肝肝衰竭患者的尿液代謝組學研究[D]. 杭州：浙江大學，2011.

[24] 麻春玲，謝雯. 高危人群護好你的肝[J]. 生活與健康，2010（7）：6-9.

[25] 朱蔚莉，李可基. 肌酸補充與骨骼肌糖代謝[J].體育科學，2006，26（1）：71-73.

[26] 郭德兵. 補充肌酸對運動能力的影響[J]. 韶關學院學報：自然科學版，2010，31（3）：137-140.

[27] 鄒和建. 多發性肌炎和皮肌炎[J]. 醫師進修雜志：內科版，2004，27（12）：7-10.