熱處理對大鼠骨骼肌內質網應激的影響及對骨骼肌適應性的保護作用

摘 要：為了研究熱處理對大鼠骨骼肌內質網應激影響及對骨骼肌的保護作用，采用遞增的熱處理為研究手段，將SD大鼠被隨機分成安靜對照組（C）和熱處理組（H），其中熱處理組按照熱處理完成后的時間再分為熱處理即刻組（H1）、熱處理24 h組（H2）、熱處理48 h組（H3）和熱處理6 d組（H4），每組8只。結果顯示：熱處理后H1、H2、H3組CK、LDH濃度都比C組低，但差異無顯著性意義；熱處理H2組SOD活性最高，與C組比較呈顯著性差異（P<0.05），且H2組MDA濃度顯著低于C組（P<0.05），其余各組低于C組，但無顯著性差異；熱處理后H1、H2、H3組骨骼肌中GRP78的表達量與C組呈顯著增加。結果表明：熱處理后大鼠骨骼肌產生應激蛋白，發(fā)生內質網應激反應，并使大鼠骨骼肌產生了適應性保護，從而避免骨骼肌的損傷。

關 鍵 詞：運動生物化學；熱處理；骨骼??；內質網應激；適應性保護；大鼠

中圖分類號：G804.7 文獻標志碼：A 文章編號：1006-7116（2013）03-0130-04

研究證實，熱應激能明顯改善心肌缺血再灌注所受損傷[1]，機體細胞這種經歷應激狀態(tài)后改變細胞表型增強抵抗所受損傷的能力稱之為預適應，這種熱應激的保護作用與熱休克蛋白的增加密切相關。內質網在受到長時間應激會發(fā)生內質網應激反應產生應激蛋白，對細胞發(fā)揮保護作用，其中某些應激蛋白屬于熱休克蛋白，如GRP78/Bip，因此推測熱應激對機體的作用可能通過內質網應激反應來實現，而目前從內質網應激的角度去探討熱應激的文獻非常少。本研究旨在從內質網應激的角度，研究熱處理對大鼠骨骼肌內質網應激的影響，并從內質網應激的角度探討熱應激內源性抗損傷的適應性保護作用機制，為熱應激處理在運動醫(yī)學中的應用提供依據。

1 實驗動物與方法

1.1 實驗動物及分組

清潔級雄性SD大鼠40只，平均體質量為（140.25±12.34） g，購自南方醫(yī)科大學實驗動物中心，置于溫度為（22.0±0.3） ℃，濕度50%～60%下清潔級動物房中喂養(yǎng)，所有動物自由飲食、飲水。大鼠在適應性喂養(yǎng)3 d后隨機分成對照組（C）（8只）和熱處理組（H）（32只）。其中熱處理組在熱適應完畢后，再按具體宰殺時間進行分組：預處理即刻組（H1）、熱處理24 h組（H2）、熱處理48 h（H3）以及熱處理后6 d（H4）組。

1.2 實驗方案

熱處理模型在參照Currie R W[2]和Diana A[3]熱模型的基礎上建立。本實驗設定熱處理的溫度堅持以下原則，避免熱處理時大鼠所受其他刺激的影響，采用非麻醉方式進行；保證大鼠熱處理后不會因溫度原因而死亡。大鼠置于恒溫桑拿環(huán)境中加熱，并監(jiān)測肛溫。熱干預4 d為一個周期，3 d熱處理，1 d休息。一共4個周期，熱處理溫度依次遞增，濕度控制在50%，監(jiān)測大鼠直腸溫度達到預期值以后維持15 min。每次熱處理總時間約為30～35 min。熱處理期間，嚴格控制溫度和濕度，并觀察大鼠行為，整個熱處理期間溫度及濕度控制如表1。

1.3 動物取材

熱處理大鼠在完成熱處理后宰殺。宰殺時采用質量分數為7%水合氯醛（每100 g體重0.4 mL）腹腔注射麻醉。腹主動脈取血后放入抗凝管，分離血清后置于-70 ℃冰箱中保存待用；取血后進行腓腸肌分離，所得腓腸肌用4 ℃預冷的生理鹽水清洗后用濾紙吸干，鋁紙包裹置于液氮中保存。

1.4 測試方法

采用酶動力法并利用721分光光度計測試血清CK、LDH濃度，試劑由上海滬峰生物科技有限公司提供；采用黃嘌呤氧化酶法測試血清SOD，硫代巴比妥酸（TBA）法測試MDA，試劑由南京建成生物工程研究所提供，檢測方法嚴格按照試劑盒所說明進行；GRP78測定通過蛋白免疫印跡Westen-Blotting檢測，一抗由Santa Cruz Biotechnology公司提供，采用Image-proplus軟件進行分析，并以靶蛋白條帶積分光密度值（Integrated Absorbance，IA=平均光密度值×蛋白條帶面積）除以β-actin條帶積分光密度值的結果作為蛋白表達的相對水平。

1.5 實驗數據統(tǒng)計

實驗數據采用SPSS10.0軟件包處理，實驗結果以（ ±s）表示，采用兩樣本均數T檢驗分析，P<0.05顯著性，P<0.01非常顯著性。

2 結果及分析

2.1 熱處理對大鼠血清CK、LDH活性的影響

熱處理后不同時相CK、LDH活性變化的結果顯示，H1、H2、H3組的值都比C組低，H4組值高于C組，但各時相所測值與C組都無顯著性差異（見表2）。

2.2 熱處理對大鼠血清SOD活性及MDA濃度的影響

結果顯示，熱處理后H2組SOD活性最高，與C組比較呈顯著性差異（P<0.05）；H1、H3及H4組SOD活性都比C組高，但不呈顯著性差異；H2組MDA濃度顯著低于C組（P<0.05），其余各組低于C組，但不表現顯著差異性（見表3）。

2.3 內質網駐留分子伴侶GRP78在熱處理后大鼠骨骼肌中表達的變化

采用GRP78特異性抗體進行免疫印跡檢測，分別以β-actin蛋白條帶IA值反映其表達水平。結果顯示，熱處理結束后H1組、H2組、H3組骨骼肌中GRP78的表達量較C組非常顯著增加（P<0.01），之后出現表達下調（見圖1）。

3 討論

機體在熱應激下產生的反應是一種非特異性表達，生物體在高溫刺激后都可產生應激反應，并產生熱適應，以提高熱耐受力，提高細胞抗損傷能力，因此熱通常用來作為提高機體保護和耐受力的刺激因素。一次性的熱刺激只提供暫時的保護作用，而長時間熱刺激產生的保護作用持續(xù)時間長。研究表明，兩個星期的熱處理可明顯提高機體在細胞、器官水平以及整體水平上的對氧化應激、長時間缺血以及耐熱能力等其他應激的耐受能力[4-5]，這種保護作用可以維持終止熱處理后3～4周，使熱應激生物機體在某些功能上發(fā)生適應的改變，本實驗方案中采用了兩周左右的熱刺激。

研究表明，機體細胞內質網的穩(wěn)定對維持細胞功能起著重要作用[6]。機體在低氧、糖缺乏、自由基堆積和鈣失衡等不利環(huán)境下會導致內質網應激，激活未折疊蛋白反應，使蛋白折疊能力提高、蛋白合成抑制，以適應不利應激[7-8]的刺激，并通過內質網應激蛋白GRP78、CHOP/GADDI53及ERP72等應激蛋白反映出來。GRP78屬于內質網駐留蛋白，為特異性的內質網分子伴侶，是內質網應激的經典標志物。大量研究證明，熱休克蛋白的誘導表達是介導缺血預適應、熱處理、低氧預處理以及代謝預處理等延遲保護作用的關健的效應分子[9]，而內質網駐留蛋白GRP78與熱休克蛋白中的HSP70家族具有高度同源性，因此屬于熱休克蛋白中的HSP7O家族。本實驗中，大鼠在經過2周左右的熱刺激后，H1、H2、H3組中的大鼠骨骼肌內質網駐留蛋白GRP78較安靜對照組顯著增加，內質網駐留蛋白GRP78的大量生成，預示大鼠在熱應激過程中產生了內質網應激反應，以抵御熱刺激對骨骼肌帶來的不利影響，維護骨骼肌細胞功能的正常。

機體應激反應是細胞應激反應的綜合體現，現已證實，內質網應激反應發(fā)生在線粒體應激和細胞核應激之前，是應激發(fā)生在細胞中的最初反應，并通過GRP78等特征蛋白體現[10]。GRP78屬于葡萄糖調節(jié)蛋白，在應激反應調節(jié)時其基因的轉錄活性可提高10～25倍，表達量顯著增高，通過表達上調可緩解內質網內未折疊蛋白負荷，并與內質網中錯誤折疊和未折疊蛋白結合，可以作為分子伴侶參與蛋白質的折疊和轉運過程，從而恢復蛋白質正確結構，從而維持了內質網鈣穩(wěn)態(tài)及內環(huán)境的穩(wěn)定[11]。有實驗證明，生物體保護性預熱應激后其體內熱應激蛋白合成增加，并且應激蛋白的保護能力隨著應激后恢復時間的推移而增強，且與HSP70高表達有關。當恢復到一定時間，動物獲得最強的保護能力，此時組織的HSP70將達到高峰或是處于很高水平，而在此之后，保護能力又會隨著HSP7O的下降而降低[12-13]。本實驗中，在熱適應結束后的48 h骨骼肌內質網駐留蛋白GRP78仍然處于很高的值也證實了這種保護能力。

研究表明，細胞具有內源性的抗損傷機制，幫助其從可逆性的損傷中恢復和適應，預防下一次損傷，適當的預熱處理可以有效調動動物機體內的保護機制[14-15]，這種作用機制可能與抗氧化能力的變化有關，心肌細胞能夠在熱應激預適應后24～48 h內，通過改變細胞表型以抵抗隨后的損傷，進行自我保護[16]并增加大鼠心肌抗氧化酶Mn-SOD表達[17-18]。除心肌外，肝臟及其他器官在熱應激后也能獲得抵抗隨后氧自由基損害的能力[19]，并且這種能力與熱休克蛋白有關。本實驗熱適應結束后H2組SOD活性最高，與安靜對照組比較呈顯著性差異，雖然H1、H3及H4組SOD活性與安靜對照組相比都不呈顯著性差異，但仍比對照組的值要高，同時H2組MDA濃度顯著低于安靜對照組，同時大鼠熱適應后各時相血清CK和LDH活性比安靜組低，表明大鼠在經過一段時間的預熱適應后，機體的抗氧化能力得到了改善，提高對抗應激的能力。有研究發(fā)現，過度熱應激可能給機體帶來損傷，長時間高溫會促使機體SOD活性降低，MDA濃度增加[20]，而本實驗采取的熱適應方案并沒給大鼠帶來骨骼肌等組織的損傷，可能是本實驗大鼠熱適應的溫度不高、時間不長，并且熱適應的溫度逐漸提高，因而可能避免這一影響。

熱適應處理能夠有效調節(jié)動物器官組織和細胞的保護功能，表明機體內存有一個啟動內源性保護機制的反饋通路，預熱適應產生的作用主要通過細胞信號轉導機制來完成。內質網應激是細胞內一種自我保護性應激機制的體現，與細胞內多種信號轉導通路和調控有關。熱環(huán)境下機體新陳代謝的加快，改變了細胞內環(huán)境狀態(tài)，誘導細胞產生內質網應激反應，生成內質網應激相關蛋白，啟動細胞應激反應信號轉導通路，并可能通過反饋作用促進機體內源性抗氧化物酶蛋白的生成，增加抗氧化物活性，減少氧自由基的產生，阻止細胞損傷，增強細胞耐受力，同時激活機體的免疫機制，增強機體對外界損傷的抗御能力[21]。

本實驗通過熱處理使大鼠骨骼肌產生內質網應激反應并誘導大鼠骨骼肌功能發(fā)生適應性改變，同時增加了骨骼肌抗損傷能力，有利于骨骼肌的保護。由于內質網應激是維持細胞功能的重要手段，因此可以利用熱適應提前誘導骨骼肌細胞產生內質網應激，從而提高骨骼肌細胞抵御未來不利環(huán)境的刺激，為從內質網應激的角度探討運動性損傷的防治提供新的可能途徑和依據。

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