水稻基因類型與生長環境對精米中砷積累的影響

段桂蘭，張紅梅，劉云霞，胡瑩，程旺大，*

1.中國科學院生態環境研究中心，北京100085

2.浙江省嘉興市農業科學研究院，嘉興314016

砷(As)在自然界中普遍存在，其含量豐度在地殼中為第20 位。As 對動植物都具有強烈的毒害作用，無機As 是一種公認的致癌物[1]，過量攝入As 或長期微量暴露As 都會對人體健康構成嚴重危害，并誘發皮膚、腎臟、膀胱等器官和組織的癌變[2]。

自然環境中的As 主要通過飲用水、食物鏈或含As 氣體等途徑被人體吸收。As 污染的地下水嚴重危害著世界上70 多個國家或地區的數億人的身體健康[3]。在孟加拉國有1.3 億居民長期飲用受As污染的水源，8 000 多萬人的飲用水As 含量超標(世界衛生組織規定的飲用水As 含量標準為10 μg·L-1)[4]。我國也有飲用水As 含量比較高的地區，比如新疆、內蒙古和臺灣等地，在某些As 污染嚴重的地區已出現了典型的地方性As 中毒現象，如“烏腳病”[5-6]。高As 含量的地下水在一些地區不僅作為飲用水，更是農作物的主要灌溉水源，特別是水稻的灌溉水[7-8]。在孟加拉，地下水抽取量的大約95%被用于灌溉，主要用于旱季稻的生產，每年通過灌溉水進入稻田的As 約為1 000 t[9-10]。

水稻是我國及東南亞地區的主要糧食作物，全球一半以上的人口以稻米為主食，我國的水稻總產量和種植面積分居世界第1 和第2 位[11]。同時，由于水稻的淹水生長環境和硅富集、根泌氧等生理特性，使水稻對As 的吸收和富集能力明顯強于小麥、大麥等其他大宗農作物，導致大米中As 的背景值濃度通常比其他農作物籽粒中As 的背景濃度高1個數量級[12-13]。而且，在東南亞地區的稻米中，毒性最強的無機As 是As 的主要存在形態[14-15]。因此，對于東南亞地區以大米為主食的居民，稻米的食用已成為人體攝入As 的最重要途徑之一[16-19]。各國政府在大力控制飲用水As 污染的同時，應重視水稻As 污染對人類健康的風險，切實解決有關地區的水稻As 污染問題[15,20]。

為控制大米As 污染，最直接有效的方法就是停止使用As 污染的稻田種植水稻，并停止使用As污染的地下水灌溉水稻。但是，在東南亞地區，人多地少，水資源緊缺，大米需求量大，因此，對于東南亞地區大面積的輕度或中度As 污染的稻田，需要有效可行的措施以同時確保水稻生產的產出和安全。大量研究已證明不同品種的水稻，其稻米中的As累積能力差異較大[21-23]。通過在中國、美國和孟加拉國多個田間實驗，Norton 等[24]發現，300 多個水稻品種中，其籽粒As 濃度相差達3 ～34 倍，遺傳變異占總變異的40%～64%。不同地區所產的水稻，其籽粒中的As 濃度也存在顯著的差異，Meharg等[15]分析了從4 大洲的10 個國家的大米背景值As濃度，發現埃及(0.04 mg·kg-1)和印度(0.07 mg·kg-1)的樣品總As 濃度最低，而美國(0.25 mg·kg-1)和法國(0.28 mg·kg-1)的樣品總As 濃度最高;大米中無機As 占總As 的比例也有顯著的地區性差異，孟加拉和印度所產大米的無機As 含量比較高，而美國產大米的有機As 含量比例較高。同樣，通過在中國、印度和孟加拉國的As 污染稻田布置田間實驗，結果也證明水稻基因型與環境效用及其相互作用對水稻籽粒中As 積累均有極顯著影響[22]。這些研究結果說明，針對某一特定地區的土壤環境和水資源特征，篩選或培育低As 積累的水稻品種是經濟有效地降低大米As 積累的重要途徑。

浙江省在經濟不斷發展的同時，重金屬污染問題日益受到人們的關注，重金屬污染的綜合防治是未來幾年環保專項行動的重中之重。水稻一直是浙江的主要農作物，水稻的安全生產與糧食增產、社會穩定、人們的健康密切相關。本研究在浙江省嘉興市選擇不同區域的5 塊水稻田，比較了20 個當地主栽的水稻品種在這些實驗點種植所得精米中的As 含量。同時在嘉興市農業科學研究院布置了人工添加As 的盆栽模擬實驗，研究在較高As 污染條件下水稻基因型差異對籽粒As 積累的影響。通過大田實驗與盆栽模擬相結合的方法，明確了水稻基因型與環境效應及其相互作用對精米中As 積累的影響，并且篩選得到一些當地籽粒中低As 積累水稻基因型。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗點介紹及盆栽實驗

本實驗于2009 年開始進行。5 個大田實驗點分別是:1)嘉興市秀洲區王江涇鎮的嘉興市農業科學研究院實驗基地(N 30°50.133'，E 120°43.046')，該地塊的土壤As 濃度較低，可作為實驗的對照地塊;2)嘉興市南湖區新豐鎮已連續8 年以上施用生豬養殖排泄物和沼液田塊(N 30°04.007'，E 120°54.348')，由于長期施用沼渣或沼液，可能導致土壤中的As、銅(Cu)、鋅(Zn)等重金屬長期積累;3)嘉興市南湖區余新鎮工業污染田(N 30°42.174'，E 120°48.611')，該地塊由于工業廢棄物的排放，可能導致土壤中重金屬積累;4)桐鄉市高橋鎮可能污染田(N 30°32.300'，E 120°34.422');5)桐鄉市屠甸鎮可能的工業污染田(N 30°35.264'，E 120°37.638')。

盆栽實驗:在浙江省嘉興市農業科學研究院的溫室大棚進行盆栽實驗。在盆栽之前，將市農科院實驗基地水稻土風干、磨碎后過2 mm 篩，然后將肥料與As 拌入土壤，N、P、K 肥料分別以CO(NH2)2、CaHPO4·H2O 和KCl 的方式加入，包括P 肥0.15 g·kg-1(以P2O5計)、K 肥0.20 g·kg-1(以K2O 計)和N肥0.20 g·kg-1(以N 計);As 以Na3AsO4·12H2O 的方式加入，10 mg·kg-1(以As 計)。將肥料和As 攪拌均勻的土壤裝入塑料盆缽中，每盆10 kg 土壤。加水保持3 ～4 cm 水位，平衡1 周后用于水稻秧苗移栽。每盆栽1 棵水稻秧苗，同時做3 組平行。所有的實驗盆在溫室里隨機擺設，不定期加水，并且調換塑料盆的位置，直到水稻收割。

1.2 植物材料及栽培方法

在前期篩選實驗基礎上[25]，水稻(Oryza sativa L.)種子從嘉興市農科院獲得，包括當地主栽品種或即將進入省區試的品系(有可能成為主栽的品種)，包括粳稻18 個和糯稻2 個共20 個水稻基因型(表1)。

表1 實驗所用的20 個水稻品種Table 1 Twenty rice genotypes used in this study

水稻種子經線菌靈浸種、催芽后，統一于嘉興市農科院實驗基地育秧。25 d 后，將秧苗移栽到各個實驗點的稻田。每個實驗點設3 次重復，每個重復內20 個水稻基因型隨機移栽，每個基因型種植5行，每行10 穴，每穴1 株秧苗，秧苗的行列間距為20 cm。水稻移栽前后，以及水稻生長到收割這段時期中，田間的管理措施如施肥、灌溉、排水和農藥等都是按照當地農民傳統進行。

1.3 植物樣品的制備與分析方法

水稻成熟后，從每個實驗小區的40 ～50 株水稻收集50 個稻穗，然后手工將稻谷從稻穗上脫落下來，裝入網袋，于室內通風處自然風干。自然風干后用脫殼機將稻谷分成谷殼和糙米兩部分，糙米進一步經過去糠處理，最后用不銹鋼粉碎機粉碎成粉，室溫保存待分析。

土壤樣品于水稻收獲后采集，在每個實驗小區根據對角線布點，多點取樣，再混合成一個混合樣品的原則，取3 個0 ～20 cm 的土壤混合樣品。土壤樣品風干、磨碎后過2 mm 篩。室溫保存待分析。

大米樣品分析:稱取0.2 g 精米粉末于50 mL離心管中，加入2 mL 優級純硝酸，混勻后室溫下平衡過夜，用微波消煮爐(MARS5,CEM Microwave Technology Ltd.Matthews,USA)進行消煮，消煮程序是55℃，10 min;75℃，10 min;95℃，30 min?？瞻缀蜆藴蕵悠?GBW 07605 國家標準物質研究中心)同時消煮，以確保消煮及以后測定的準確度和用于回收率的計算。消煮后的樣品用超純水(EASYpure LF,Barnstead International,Dubuque,IA,USA)稀釋至50 mL，用定量濾紙過濾以除去雜質，4℃保存。總As 濃度用電感耦合等離子體質譜系統(ICPMS 7500，安捷倫科技，美國)進行測定。

土壤樣品的分析:稱取0.1 g 土壤樣品于50 mL離心管中，加入2.5 mL 優級純硝酸，混勻后室溫下平衡過夜。平衡后的土壤溶液采用開放式消煮爐消解，消解程序是100℃，1 h;120℃，1 h;140℃，一直消煮到溶液清澈。空白和標準樣品同時消煮。稀釋和測定方法與大米樣品的方法一致。

1.4 統計方法

實驗數據采用SPSS11.5 軟件進行方差分析和多重比較(Student-Newman-keuls 檢驗)(P ＜0.05)，采用SigmaPlot 9.0 軟件作圖。

2 結果(Results)

2.1 土壤中總As 含量

嘉興市農科院實驗基地的土壤As 含量較低，為6.26 mg·kg-1;新豐鎮生豬養殖排泄物和沼液施肥田塊的土壤As 含量為7.89 mg·kg-1，相對于農科院對照土壤，As 含量提高了26.08%;余新鎮工業污染田塊的土壤As 含量為13.34 mg·kg-1，比對照土壤提高了113.08%;高橋鎮可能污染田塊的土壤As含量為7.14 mg·kg-1，比對照土壤提高了14.13%;屠甸鎮工業園區附近田塊的土壤As 含量為8.20 mg·kg-1，比對照土壤提高了31.07%。

2.2 精米中As 含量的基因型差異

為比較水稻籽粒As 積累的基因型差異，本研究比較了20 個水稻品種在不同栽培環境條件下的精米中As 含量。結果表明，在所有的環境條件下，20 個水稻品種的精米As 含量都呈現顯著的基因型差異(表2，圖1)。如余新鎮種植的精米，基因型18(G18)的As 濃度是57.80 μg·kg-1，而基因型20(G20)的As 濃度是126.39 μg·kg-1。相同條件下，不同基因型精米中As 濃度的最大值與最小值的比值在1.82 ～2.19之間，變異系數在人工添加As 的盆栽模擬條件下最大，達到22.69%，其他條件下在15.10%～18.68%之間(表2，圖1)。

圖1 20 種不同品種水稻在各地區種植的精米中As 濃度注:箱形圖的上下邊界代表75%及25%分位數(四分位數)，中線代表中位數，誤差線代表10%及90%分位數，各個點代表不同水稻品種的精米中As 濃度值。Fig.1 As concentrations in polished grains of 20 rice genotypes harvested from different sites

表2 各地區種植的20 種不同水稻品種的精米中As 濃度差異Table 2 Difference of As concentrations in polished grains of 20 rice genotypes harvested from each site

2.3 精米中As 含量的環境變異

為比較水稻籽粒As 積累的基因型差異，本研究比較了6 種環境條件下種植的精米As 含量。結果表明，所有水稻品種的精米As 含量都呈現顯著的環境變異(表3，圖1)，例如，基因型20(G20)在盆栽條件下栽培時，精米中As 的濃度最高，達到255.78 μg·kg-1，而在農科院對照土壤條件下栽培時，精米As 濃度最低，為69.70 μg·kg-1。同一品種在不同環境條件下，精米中As 含量的最大值與最小值的比值在1.86 ～3.76之間，但不同品種對環境變化的響應不同，變異系數在25.62%～63.95%之間(表3，圖1)。

表3 各水稻品種在不同地區種植時精米中的As 濃度差異Table 3 Difference of As concentrations in polished grains of the same genotype harvested from different sites

2.4 精米中As 含量的方差分析

通過方差分析(表4)，發現水稻基因型對精米中As 含量有極顯著的影響，F品種=12.38 ＞F0.01(19,139)=2.04 ，P ＜0.001;環境條件對精米中As 含量有極顯著的影響，F地區=369.62 ＞F0.01(5,139)=3.15，P ＜0.001 ;同樣，水稻品種和種植地區的相互作用均對精米中As 含量有極顯著影響，F品種×地區=3.33 ＞F0.01(95,139)=1.54，P ＜0.001。

表4 精米中As 濃度的方差分析Table 4 Analysis of variance in As concentrations in polished grains

2.5 籽粒低As 積累水稻品種的篩選

在相同條件下，將20 個水稻品種的精米As 含量由低到高進行排序，最低的序列為1，最高的序列為20。通過對6 種條件下同一品種的序列數求平均值，得到該品種的精米中As 含量由低到高的排序(圖2)。結果表明，一些基因型的精米As 積累在所有條件下均較低。例如，基因型1、2、3、5 和11(G1、G2、G3、G5 和G11)的平均排序都在5 以下，說明這些籽粒As 低積累的基因型推廣應用后精米As污染的風險相對較低;與此相反，也有一些基因型的精米As 積累在所有條件下都較高，例如，基因型6、10 和20(G6、G10 和G20)的平均排序都在15 以上，因此，這些品種應盡量避免在As 污染的地區種植。

圖2 20 種水稻的精米中As 濃度的排列序數Fig.2 Rank of As concentrations in polished grains of 20 rice genotypes

3 討論(Discussion)

稻田及稻米的As 污染及其控制技術是我國及其他東南亞地區非常突出且急需解決的環境問題之一。篩選或培育籽粒低As 積累的水稻品種，被廣泛認為是一條經濟、有效的降低稻米As 積累的重要途徑[20,22]。本研究所比較的20 個水稻品種包括粳稻和糯稻，這些品種大多數都是浙江省嘉興市農科院育成的高產、優質、多抗品種，已在我國浙江、上海、江蘇等地稻區推廣種植。重金屬的積累是水稻安全生產的重要評價指標[26]，筆者前期已經對部分品種的重金屬積累能力進行鑒定，例如，秀水128和秀水09 的籽粒中鎘、鉛、As 等有毒元素積累都較低，被作為環保型的新品種而推廣種植[23]。在本研究中，這2 個水稻品種被再次證明其精米中的As濃度較低(圖2)。另外，甬粳16、Y-05-8、秀水134等基因型的精米As 積累也較低。推廣種植這些低As 積累的水稻品種可為輕、中度As 污染稻田的大米安全生產提供一條經濟、有效的途徑。

大米中As 的積累不僅受水稻基因型的調控，同時也受到環境條件以及環境與基因型交互作用的顯著影響(表3、表4 和圖1)。本研究在浙江省嘉興市5 個不同區域選擇5 塊水稻田，這些田塊的土壤總As 含量差別顯著，在6.26 ～13.34 mg·kg-1之間，而且As 的污染來源不同，有工業廢棄物排放、施用有機肥等原因造成的土壤As 污染。結果表明，同一水稻基因型，在不同地區種植時，其精米中的As含量差異顯著。例如，秀水114(G10)，在嘉興市農科院實驗基地種植時，精米中的As 濃度是66.58 mg·kg-1，在新豐鎮有機肥施肥田塊種植時，精米中的As 濃度是102.58 mg·kg-1，而在人工添加As 的盆栽時，精米中的As 濃度達到207.70 mg·kg-1，變異系數是41.18%。另外，值得注意的是，精米中的As 含量與土壤總As 含量并沒有明顯的相關性。本研究的5 個大田實驗中，余新鎮工業污染田塊的土壤As 濃度最高(13.34 mg·kg-1)，顯著高于新豐鎮施生豬養殖排泄物田塊的土壤As 濃度(7.89 mg·kg-1)，但兩地區所產精米的As 平均濃度卻沒有顯著差異。這可能與土壤中As 的生物有效性有關，Duan 等[27]證明，生豬養殖排泄物和沼液中的As 具有較高的從土壤到植物的生物轉移系數，其生物有效性較高。

稻米中As 的積累受到環境、遺傳及環境與遺傳交互作用的顯著影響。因此，大米的安全生產首先必須確保農田土壤環境的潔凈，嚴禁在As 污染嚴重或高背景值的“問題土壤”條件下種植水稻，在輕、中度As 污染地區需要采取適當的措施降低稻田土壤中As 的生物有效性，同時需要篩選并推廣種植籽粒中低As 積累的水稻品種。多措施并用、多學科交叉將是實現東南亞地區大米安全生產的有效途徑。

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