鏈霉菌的抗砷特性及其對蜈蚣草富集砷的作用

文一，廖曉勇，閻秀蘭

1.中國科學院地理科學與資源研究所 場地污染評估與修復中關村開放實驗室，北京100101

2.環境保護部環境規劃院，北京100012

砷是一種廣泛存在于環境中的類金屬元素，可導致人體患皮膚癌、肺癌以及糖尿病、皮膚病、神經和心血管類等非癌癥疾病[1]。砷污染已影響全世界數百萬人的健康，成為全球關注的環境問題[2]。世界上有19 個國家和地區爆發過嚴重的砷污染危害事件，中國是遭受砷毒害最為嚴重的國家之一，已發生的砷中毒涉及到全國8 個省和37 個縣[3]。砷污染治理是國際上面臨的亟待解決的重要環境課題，在我國的《重金屬污染綜合防治“十二五”規劃》中已將砷作為重點防治對象。

傳統的砷污染土壤治理方法包括填埋法、固化/穩定化、化學淋濾等方法，近年來基于超富集植物蜈蚣草(Pteris vittata L.)的砷污染土壤植物修復技術被認為是應用前景廣闊、修復成本低、且二次風險少的方法[4]。蜈蚣草的砷累積量可占總生物干質量的2.3%[5]，能提取土壤中不同形態的砷(非專性吸附態、專性結合態、無定型水合氧化態、結晶水合氧化態以及殘渣態砷)，其中對無定型水合氧化態砷的提取可占提取總砷的67%～77%[6]。

借用強化手段，進一步提升蜈蚣草富集砷的能力是近期國內外研究的重點。微生物可通過自身或其代謝產物促進植物根系發育、增加生物量，提高植物對不同環境壓力的耐受力，改變土壤中重金屬的形態，增加重金屬的生物可利用性，來強化植物的修復效率[7]。例如，接種細菌后，能增加植物生長促生長素及1-氨基環丙烷-1-羧酸(ACC)脫氨酶的生成，促進油菜對砷、銅、鎳的吸收[8];細菌還能通過促進植物根系發育，增加生長素(IAA)、鐵運載體的分泌，促進芥菜對鉻、鋅及鉛的吸收[9]。本文以從高砷土壤中生長的的蜈蚣草根際土壤中篩選出菌株——鏈霉菌(Streptomyces sp.)作為供試微生物，研究其抗砷性能及其對蜈蚣草富集砷的作用，從菌株對根際環境影響的角度探討其對砷在土壤-超富集植物根際系統中轉運的影響。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

1.1.1 供試盆栽土

取自湖南郴州鄧家塘砷污染土壤(北緯24°53'～26°50'，東經112°50'～114°14'，海拔344 m)，其基本理化性質為:pH 值為7.34，有機質含量為18.4 g·kg-1，陽離子交換量(CEC)為26 cmol·kg-1，總砷含量為115.74 mg·kg-1，全磷為22.95 g·kg-1，全氮為1.61 g·kg-1。土壤為細砂土，砂粒體積分數為59.9%，粉粒為24.7%，粘粒為15.4%。供試土壤室內自然風干，磨碎，過2 mm 篩，混勻，備用。

1.1.2 供試植物

蜈蚣草為湖南郴州無砷污染土壤的野生植株，選擇株高5 ～10 cm、4 ～5 片羽葉、根莖大小一致的植株。每盆移栽1 株蜈蚣草。溫室溫度控制在22℃～25℃之間，室內相對濕度控制在75%～80%。

1.1.3 供試菌株及菌液制備

供試菌種篩選自砷含量為90 ～300 mg·kg-1污染土壤中的土著鏈霉菌(Streptomyces sp.)，經鑒定其含有參與砷還原轉化的arsC 基因。利用胰蛋白胨大豆肉湯培養基(TSB)培養基，在30℃、220 r·min-1下振蕩培養36 h，制備發酵液。在4℃、6 000 r·min-1下離心10 min，棄去上清液，沉淀用無菌去離子水清洗2 次。用無菌去離子水配制成菌懸液。將Streptomyces sp.菌液的濃度調整為3×106cfu·mL-1，取800 mL 的發菌液在高壓滅菌鍋中于121℃、15 min 下處理制成滅活菌液。

1.1.4 試劑

砷酸鈉(Na3AsO4·12H2O)等化學試劑為國產分析純試劑。TSB 培養基購自美國BD 公司。

1.2 實驗方法

(1)菌株抗砷性能的測定:取在600 nm 吸光值為0.8 的菌液1 mL，接種于含100 mL TSB 培養基的500 mL 三角錐形瓶中，24 h 后，在菌液中加入不同濃度的砷酸鈉(用無菌水配置，并過無菌濾膜，保證無菌)，配制成含0、20、40、60、80 和100 mmol·L-1砷酸鈉的發酵液。在30℃、220 r·min-1下水浴振蕩培養。24 h 后，收獲菌液，4℃、7 000 r·min-1下離心，用蒸餾水洗滌2 次，在80℃烘至恒重，稱取菌絲質量。每個處理3 個重復。

(2)菌株砷還原能力的測定:取在600 nm 吸光值為0.8 的菌液1 mL，接種于含100 mL TSB 培養基的500 mL 三角錐形瓶中，培養24 h 后加入砷酸鈉(用無菌水配置，并過無菌濾膜，保證無菌)，配制成75 mg·L-1的砷酸鈉發酵液，用含相同砷酸鹽濃度的滅活菌液作為對照。每隔6 h，從活性菌液和對照組菌液中各取出4 mL，7 000 r·min-1下離心，測定上清液中As(Ⅲ)和As(Ⅴ)的含量。每個處理3 個重復。

(3)盆栽實驗共設4 個處理，分別是不添加菌的空白對照處理組(CK)、不添加菌但種植蜈蚣草的植物對照處理組(CK+P)、Streptomyces sp.菌液處理組(S)、施加Streptomyces sp.菌液并種植蜈蚣草處理(S+P)，每個處理設4 個重復。蜈蚣草移栽7 d 確保成活后，在CK、CK+P 處理組中施入100 mL 滅活菌液，在S 和S+P 處理組中施入100 mL 活性菌液，菌液采用針頭，通過根際灌注和表層噴灑的方式施加，添加后適當翻動表層土壤，使菌液在表層土壤(0 ～10 cm)混合均勻。60 d 時收獲植物和土壤，利用晃動根部，獲得非粘附的土壤，作為非根際土。用軟毛刷刷下粘附在根際的土壤作為根際土。土壤樣品分成3 份，一份在室內自然風干，用于測定總砷、砷結合態;一份保存在4℃，用于測定可溶性有機碳(DOC);一份保存在-80℃，用于測定砷形態。植物先用自來水沖洗干凈，然后用去離子水洗滌3 遍。植株上的水珠用濾紙吸干，稱取植物生物質量，將植物分為地上部、地下部在烘箱烘干，用于總砷測定。

1.3 檢測方法

采用硝酸-雙氧水消煮土壤樣品，硝酸-高氯酸消煮植物樣品，用原子熒光分光光度計測定總砷含量[10]。用的磷酸抗壞血酸提取土壤中砷[11]，用1∶1 甲醇水提取植物樣品中的砷[12]，用液相色譜-原子熒光光譜聯用(LC-AFS)測定砷形態。土壤砷結合態分析采用武斌等分級方法連續提取[13]。定量稱取10 g 土壤，置于150 mL 三角瓶中，加入50 mL 超純水;連續振蕩2 h，3 500×g 下離心15 min，過0.45 μm水系濾膜;取10 mL 水樣，利用TOC 分析儀測定[14]。選用水土比1∶2，混勻后放置15 min，利用pH 計測定。

1.4 數據處理

所獲數據利用Excel 和SPSS13.0 軟件進行統計分析及差異顯著性檢驗。

2 結果(Results)

2.1 Streptomyces sp.的抗砷及還原砷能力

由圖1 可見，當砷酸鹽濃度從0 增加到40 mmol·L-1時，Streptomyces sp.的菌絲干質量隨砷酸鹽濃度的增加大幅度下降，但隨著砷酸鹽濃度的進一步升高(40 ～100 mmol·L-1)，菌絲的干質量變化不大，由此可見，雖然砷能抑制Streptomyces sp.的正常生長，但該菌仍表現出極強的耐砷能力。

圖1 不同濃度砷酸鹽中Streptomyces sp.的生長情況Fig.1 Growth of Streptomyces sp.in different concentrations of arsenate

在有氧條件下，Streptomyces sp.能有效地將As(V)還原為As(III)，在培養48 h 后，活性菌液處理組中的As(III)濃度達到60.08 mg·L-1，還原率達到96.5%。48 h 后As(III)的濃度變化漸趨平緩。微生物失活的對照組培養液中未檢測出As(III)，該結果表明As(V)還原主要是菌劑Streptomyces sp.的作用(圖2)。

圖2 Streptomyces sp.對砷酸鹽的還原能力Fig.2 Arsenate reduction ability of Streptomyces sp.

2.2 Streptomyces sp.對蜈蚣草生長的影響

圖3 Streptomyces sp.對蜈蚣草生長的影響Fig.3 Effect of Streptomyces sp.on growth of P.vittata

施用Streptomyces sp.對蜈蚣草生長的影響見圖3。施加Streptomyces sp.的處理組中蜈蚣草地上、地下部分質量和生物總質量均高于施用滅菌處理的對照組，分別升高了16.91%、2.84%和10.04%。但統計結果無顯著性差異。

2.3 添加Streptomyces sp.對蜈蚣草砷富集的影響

施加Streptomyces sp.對蜈蚣草砷吸收的影響見圖4A。添加Streptomyces sp.處理組蜈蚣草的地上部砷含量為930 mg·kg-1，顯著高于對照組(CK+P)的地上部砷含量(P ＜0.05)，為對照組的1.76 倍。添加Streptomyces sp.的處理組中蜈蚣草的轉運系數為2.22，是對照組的2.05 倍，表明添加Streptomyces sp.能顯著提高蜈蚣草地上部對砷的吸收，促進蜈蚣草對砷從地下到地上部的轉運。施用Streptomyces sp.處理后，蜈蚣草地下部砷濃度比對照組低14.41%，但未達顯著性差異。添加Streptomyces sp.后對蜈蚣草砷累積的影響見圖4B。與對照組相比，施用菌劑Streptomyces sp.能顯著提高蜈蚣草地上部砷累積量(P ＜0.05)，蜈蚣草地上部累積量是對照組的2.09 倍。施菌處理后，由于地下部生物量以及施菌對砷轉運的影響，Streptomyces sp.地下部砷累積量較對照組降低了38.19%，差異顯著(P ＜0.05)。以上結果表明，供試微生物Streptomyces sp.能強化蜈蚣草提取土壤砷，促進砷從蜈蚣草地下部向地上部轉運，它可以作為強化植物砷修復的微生物材料。

圖4 Streptomyces sp.菌對蜈蚣草砷累積的影響注:A，蜈蚣草砷濃度;B，蜈蚣草砷累積量。Fig.4 Effect of Streptomyces sp.on As accumulation of P.vittata

2.4 Streptomyces sp.對土壤總砷含量的影響

添加抗砷菌Streptomyces sp.后，蜈蚣草根際土壤的總砷濃度較其他各組均有顯著下降(P ＜0.05)。與不種植物的對照組(CK)及菌土(S)組相比，分別降低了32.93%和33.99%;與對照組(CK+P)根際土壤相比，下降了22.06%。由于蜈蚣草對砷的超富集作用，CK+P 組的根際土壤砷含量與CK 和S 組比較，表現為顯著降低(P ＜0.05)，分別降低了18.93% 和18.06%，其砷含量下降量低于施加Streptomyces sp.菌處理(S+P)的蜈蚣草根際土壤。將蜈蚣草和微生物作為影響土壤總砷含量變化的因素，對根際土壤進行考慮交互作用的雙因素方差分析，分析表明:施用Streptomyces sp.和種植蜈蚣草對土壤總砷含量的影響無明顯的交互作用(F=1.80，P=0.21)。由表1 可見，Streptomyces sp.能有效增強蜈蚣草對根際土壤砷的去除能力，但在本實驗條件下，Streptomyces sp.和蜈蚣草對于根際土壤砷去除能力未出現交互作用，表現為相加作用。

表1 Streptomyces sp.對土壤中砷濃度的影響Table 1 Effect of Streptomyces sp.on As concentration in soil

2.5 Streptomyces sp.對土壤中砷形態及價態的影響

添加Streptomyces sp.各處理組土壤砷形態結果見表2。各處理組中的土壤均能檢測到As(Ⅴ)和As(Ⅲ)，其中以As(Ⅴ)為主，占土壤總砷的86.30%～99.43%，As(Ⅲ)中占土壤總砷的0.56% ～8.15%，S 組及S+P 組土壤中As(Ⅲ)濃度較高。由表2 可知，Streptomyces sp.菌土組(S 組)中的As(Ⅲ)濃度是CK 組的2.03 倍，具有顯著性差異(P ＜0.05)，表明Streptomyces sp.在盆栽條下能促進土壤中As(Ⅴ)的還原。施加Streptomyces sp.后，蜈蚣草根際土壤的As(Ⅲ)濃度顯著高于其他處理組(P ＜0.05)，是CK 的7.23 倍，是CK+P 組根際土壤的5.33 倍。將蜈蚣草和微生物作為影響土壤As(Ⅲ)變化的因素，對根際土壤進行考慮交互作用的雙因素方差分析，蜈蚣草和Streptomyces sp.對根際土壤中As(Ⅲ)具有顯著交互作用(P ＜0.05)，能顯著增加根際土壤中的As(Ⅲ)濃度。以上結果表明，加入Streptomyces sp.菌后，能促進根際土壤中As(Ⅴ)還原成As(Ⅲ)，Streptomyces sp.和蜈蚣草對于這一過程具有協同作用。

表2 Streptomyces sp.對土壤中砷價態的影響Table 2 Effect of Streptomyces sp.on As speciation in soil

Streptomyces sp.對土壤砷結合形態的影響見表3，添加Streptomyces sp.菌液的土壤的殘渣態砷(O-As)顯著低于CK，下降了24.49%(P ＜0.05)，表明抗砷菌Streptomyces sp.在土壤中可促進土壤中生物有效性最低的殘渣態砷的轉化。與CK 比較，S+P 處理組根際土壤松散態結合砷(L-As)、鋁結合態砷(Al-As)、鐵結合態砷(Fe-As)和殘渣態砷(O-As)等4 種砷形態的含量均顯著降低(P ＜0.05)，分別下降了86.16%、67.79%、49.48%和40.29%，其中OAs 從48.15 mg·kg-1下降至28.75 mg·kg-1，占S+P處理組根際土壤總砷含量下降的49.74%。與CK+P 相比，S+P 處理組的蜈蚣草根際土壤的Al-As、Fe-As 和O-As 含量均顯著降低(P ＜0.05)，分別下降了50.82%、38.39%和45.64%。這說明，抗砷菌Streptomyces sp.能通過增強蜈蚣草對根際土壤的Al-As、Fe-As 以及O-As 等生物有效性低的砷形態的吸收利用，提高蜈蚣草對根際土壤砷的提取作用。

表3 Streptomyces sp.對土壤砷結合形態的影響Table 3 Effect of Streptomyces sp.on As fractions in soil(mg·kg-1)

2.6 Streptomyces sp.對土壤中根際環境的影響

圖5 為施加Streptomyces sp.處理后蜈蚣草根際和非根際水溶液中的pH 值。結果表明，非根際土壤溶液的pH 值為7.83 ～7.85，根際土壤溶液pH值為8.30 ～8.32，均呈弱堿性。CK+P 和S+P 處理組的蜈蚣草根際土壤均高于非根際土壤的pH值，可增加至0.47 個單位。施加Streptomyces sp.后根際和非根際土壤均比施加滅活菌液處理組的pH值增加了0.02 個單位。這表明施加Streptomyces sp.可影響土壤pH 值，從而引起根際環境的變化。

圖5 Streptomyces sp.對根際pH 值的影響Fig.5 Effect of Streptomyces sp.on pH in rhizosphere soil

添加Streptomyces sp.對蜈蚣草土壤中DOC 的影響見表4。S+P 處理組的根際土壤中DOC 的含量高于其他各組，與CK+P 根際土壤相比，增加18.10%，但未達顯著性差異(P ＞0.05);較S 和CK 組分別增加27.91%和83.70%，具有顯著性差異(P ＜0.05)。CK+P 組由于植物根際分泌物的作用，其根際DOC 的含量仍然高于S 和CK 處理組，但增加量較S+P 組的根際土壤低，分別增加8.34%和54.46%。對根際土壤DOC 含量進行交互作用分析，結果表明:蜈蚣草和Streptomyces sp.共同作用對根際土壤DOC 濃度不存在交互作用，聯合作用呈相加作用。

表4 Streptomyces sp.對土壤中DOC 的影響Table 4 Effect of Streptomyces sp.on DOC in soil(mg·kg-1)

3 討論(Discussion)

植物修復技術被認為是治理土壤砷污染最經濟有效的途徑之一[15]，然而植物修復砷的效率常受到植物生長速度和生物量、砷含量及砷的生物有效性等因素限制。筆者近年來一直探索利用微生物強化植物修復砷污染土壤，本研究結果表明,在蜈蚣草中添加抗砷微生物Streptomyces sp.后，蜈蚣草地上部砷濃度比同期對照組高75.52%，蜈蚣草總砷累積量比同期對照高45.07%，應用Streptomyces sp.能有效強化蜈蚣草對砷的吸收與富集，從而提高蜈蚣草修復砷污染土壤的效率。Ghosh 等[16]從蜈蚣草根際土壤中分離假單胞菌、叢毛單胞菌和寡養單胞菌等抗砷菌株，水培實驗結果表明，菌株能有效促進蜈蚣草的生長，增加蜈蚣草砷含量，可達對照組的1.96 倍。曾東等[17]從湖南某砷污染地區蜈蚣草根系及根系新鮮土中篩選出11 組抗砷菌，盆栽實驗結果表明，抗砷菌在一定程度上能夠刺激蜈蚣草的生長，提高蜈蚣草的生物量，促進砷由蜈蚣草的地下部向地上部轉運。Liu 等[18]發現在蜈蚣草根部中接種叢枝菌根真菌可以增加蜈蚣草生物量，促進蜈蚣草砷吸收。課題組前期研究發現，在蜈蚣草中加入Streptomyces sp.可促進蜈蚣草生物量呈顯著增加[10]，本實驗中施用含有參與砷還原轉化的arsC 基因抗砷菌Streptomyces sp.后也能促進蜈蚣草的生長，其較對照組高出10.04%。微生物通過促進植物生長，提高植物生物總量，從而增加植物對砷的積累，這是微生物提高植物修復效率的重要途徑之一。

土壤中砷主要以As(Ⅴ)為主，As(Ⅴ)通過化學吸附和(或)表面沉淀作用在土壤及粘土礦物上吸附，其移動性和生物活性都低于As(Ⅲ)[19]。已有研究表明，環境中的異化砷還原微生物可將吸附在礦物或沉積物上的As(Ⅴ)還原為具移動性和毒性更強的As(Ⅲ)，將砷從固相釋放到液相中[20]。Yamamura 等[21]將異化砷還原菌添加到含砷的土壤中，發現其可將土壤中As(Ⅴ)轉化為移動性更強的As(Ⅲ)，他認為，該種微生物為促進植物砷吸收提供了可能。本實驗研究發現，施加抗砷菌Streptomyces sp.后，蜈蚣草根際土壤中As(III)含量較植物對照組提高了4.3 倍，并且根際土壤中Al-As、Fe-As 以及O-As含量均顯著降低，為蜈蚣草提供了更多的可利用態砷。根際環境是植物根系在生理過程下形成的不同于原土的，具有特殊物理、化學和生物學性質的動態微型生態系統，其根際環境中的pH 值、根系分泌物等直接影響重金屬的固定和活化狀態，從而影響到重金屬在土壤-植物過程中的遷移轉化行為[22]。土壤pH 值變化受根系分泌物的種類與數量、微生物數量或活性影響，是影響土壤中砷吸附的重要因素。土壤pH 值影響砷的有效性，pH 值越高，土壤中的鐵、鋁氧化物易帶負電荷，有利于土壤砷的溶出，土壤有效態砷含量增加[23]。Fitz 等[24]根據已有的植物根際研究結果，推測了砷在根際中的可能變化，他認為，根際pH 值升高會造成As(Ⅴ)可溶性增加，反之則會降低。本研究結果證實了這一推測，添加抗砷菌Streptomyces sp.使蜈蚣草根際土壤的pH 值有所增加，根際As(III)含量增加，土壤中鐵、鋁結合態及殘渣態含量降低。

可溶性有機質是控制砷的遷移和轉換過程中的重要因素[25]。在有氧條件下，有機質含量可以促進微生物代謝，進一步影響砷的氧化還原作用，從而影響砷在土壤中的移動性及生物可利用性[26]。Balasoiu 等[27]報道了在鉻化砷酸銅(CCA)污染土壤中，隨著有機質含量增加，土壤中As(III)比例增加。本實驗結果表明:加入Streptomyces sp.后蜈蚣草根際DOC 含量較植物對照組增加18.10%，蜈蚣草根際As(III)較植物對照組顯著性增加。可溶性有機質可以通過競爭吸附作用減少砷在土壤表面的吸附，進而增加難溶態砷的轉化和增強砷的移動性[28]。Tu等[29]發現蜈蚣草在砷脅迫下分泌出大量的可溶解有機碳，可促進土壤中砷酸鐵(Fe-As)和砷酸鋁(Al-As)礦物溶解及砷的釋放。本研究中添加Streptomyces sp.后，隨著蜈蚣草根際DOC 含量增加，土壤中Al、Fe 結合態和殘渣態砷含量顯著降低，與Tu的研究結果一致。

綜上所述，抗砷微生物Streptomyces sp.可作為強化蜈蚣草砷修復的微生物材料，其表現出了較好的促植物砷吸收作用，Streptomyces sp.通過影響蜈蚣草根際環境，增加蜈蚣草根際土壤pH、DOC 含量促進砷形態變化，增加砷生物可利用性，從而促進蜈蚣草對砷的富集。

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