運動對骨骼肌中內質網應激反應介導的細胞凋亡分子事件影響

李海鵬，孫 泊

(1.上海體育學院 運動科學學院，上海 200438;2.臺州學院 體育科學學院，浙江 臨海 317000;3.聊城大學 體育學院，山東聊城 252059)

新近研究發現，除了原有兩條經典凋亡途徑(①TNF－α/Fas 介導的外源性死亡受體途徑和②線粒體介導的內源性損傷途徑)以外，內質網介導的應激反應途徑也參與了細胞凋亡過程［1］。對于骨骼肌而言，細胞凋亡不僅可以經由不同凋亡途徑發生，而且在各條途徑中還會涉及到諸多紛繁復雜的細胞凋亡分子事件(如Caspase 家族的級聯激活事件)。盡管目前已有不少關于運動對骨骼肌細胞凋亡影響的研究，但是現有研究多圍繞原有兩條經典凋亡途徑展開，而針對內質網應激反應(Endoplasmic Reticulum Stress，ERS)介導的信號轉導途徑中相關基因的研究少有報道［2］，一定程度上限制了研究者對運動與骨骼肌細胞凋亡過程中各凋亡途徑之間的關系以及運動誘導骨骼肌發生細胞凋亡機制等方面的認識［3－4］。鑒于此，本研究擬通過對小鼠分別進行8 周跑臺、爬梯運動干預，觀察運動對小鼠骨骼肌ERS 介導的細胞凋亡途徑中鈣調神經磷酸酶(calcineurin，CaN)活性以及相關基因(m－Calpain、Caspase－12 和Caspase－3)mRNA 表達的影響，為今后揭示運動與骨骼肌細胞凋亡各條凋亡途徑之間的關系提供一些參考。

1 研究方法

1.1 實驗動物與分組

3 月齡雄性SAMP8 小鼠24 只(體重:28.1 ±2.3 g)，購自天津中醫藥大學第一附屬醫院實驗動物中心(許可證編號:W－J 津實動質M 準字第006 號)，購入后隨機分為3 組:安靜對照組(C 組)、跑臺運動組(E 組)和爬梯運動組(R 組)，每組各8 只，在SPF 條件下分籠飼養，以國家標準嚙齒類飼料喂養，自由飲食、飲水。光照遵循明暗周期，溫度范圍20 ℃±2 ℃，相對濕度55%±5%。

1.2 運動方案

適應性飼養1 周后，E 組采用動物跑臺進行有氧運動［5］，具體運動方案為:第1 周15 m/min×15 min;第2 周為20 m/min×25 min;第3 周為25 m/min×25 min;第4 周為25 m/min×30 min;第5 ～8 周均為30 m/min×30 min，每天1 次，每周5 天，持續8 周。R 組采用負重爬梯進行抗阻運動，具體運動方案為:第1 周負重50%BW;第2 周負重50%BW;第3 周負重66%BW;第4 周負重83%BW;第5 ～7 周負重100%BW;第8 周負重83%BW，其中除第1 周訓練安排為每天3組，每組3 次以外，第2 ～8 周均為每天3 次，每組4次。每次爬梯間隔時間為20 s，每組間隔時間為2 min，訓練隔天1 次，持續8 周。所有訓練時間選擇在暗周期(18:00 ～20:00)進行。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗取材

末次運動后24 h ～48 h，小鼠斷頭處死，迅速取完整后肢腓腸肌并分成兩份，一份用于CaN 活性檢測，另一份錫箔紙包裹并標記后迅速置于液氮中，后移至－80℃超低溫冰箱保存。

1.3.2 DNA ladder 檢測

細胞凋亡采用DNA ladder 試劑盒(購自江蘇碧云天生物技術研究所)進行檢測，檢測步驟參照試劑盒說明書進行，通過凝膠電泳觀察有無梯狀條帶。

1.3.3 CaN 活性檢測

CaN 活性的檢測參照南京建成生物技術研究所提供的CaN 試劑盒說明書進行，主要用于反映細胞中Ca2+濃度的變化。

1.3.4 總RNA 的提取、逆轉錄及Real－time PCR 擴增

骨骼肌總RNA 的提取及RNA 完整性與純度的檢測參照文獻［6］進行，經檢驗總RNA 的完整性與純度均較好。然后，取RNA 2 μl 以Oligo(dT)15(50 pmol/μl)為隨機引物RNA 逆轉錄合成cDNA。Real－time PCR擴增引物由Pubmed 數據庫進行目的基因全序列查找，采用Primer Express 3.0 引物設計軟件由上海捷瑞生物公司合成，引物序列及相關信息見表1。

Realtime PCR 反應體系為20 μL，其中SYBR Premix(TOYOBO 公司)10 μL，正、反向引物(10 μM)各1 μL，模板4 μL，然后用無RNase 水補足。反應條件為95 ℃，3 min 預變性;擴增階段為95 ℃，20 s，Tm℃，20 s，72 ℃，20 s(收集熒光)，45 個循環;產物特異性檢測階段95 ℃，1 min;Tm ℃，20 s;緩慢升溫(收集熒光)至95 ℃，10 s。經儀器自動分析，各基因融解曲線均為單峰，表明擴增產物特異性較高。以β－actin為內參基因，各目的基因的相對量Relative Expression(RE)按照2－ΔΔCt計算求得。

表1 各基因引物序列及相關信息

1.4 數據處理

由SPSS for windows15.0 統計軟件包運用單因素方差分析進行數據處理。所得數據以ˉx± s 表示，差異顯著性水平定義為P〈0.05。

2 研究結果

2.1 細胞凋亡的初步檢測

經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，C 組、E 組和R 組均未見階梯狀DNA Ladder，可以初步推斷在各組小鼠骨骼肌均未呈現明顯的細胞凋亡特征(圖略)。

2.2 運動對小鼠骨骼肌中CaN 活性的影響

與C 組相比，E 組和R 組小鼠骨骼肌中CaN 活性均顯著升高(P〈0.05)(見表2)。

表2 運動對小鼠骨骼肌中CaN 活性的影響

2.3 運動對ERS 凋亡途徑中相關基因mRNA 表達的影響

與C 組相比，E 組和R 組小鼠骨骼肌中m－Calpain 與Caspase－12 mRNA 水平均分別顯著升高(P〈0.05)，但R 組小鼠骨骼肌中Caspase－3 mRNA 水平較C 組呈顯著下降(P〈0.05)，而E 組小鼠骨骼肌中Caspase－3 mRNA 水平卻未見顯著性變化(P〉0.05)(見表3)。

表3 運動對ERS 途徑中相關基因mRNA 表達的影響

3 分析與討論

內質網是細胞內Ca2+儲備的主要場所。已有研究表明，運動應激能夠引起內質網Ca2+離子通道狀態的改變，從而破壞內質網腔內的鈣穩態，通過造成胞內鈣的失衡，干擾蛋白質的正常合成、翻譯與折疊過程，并促使內質網內未折疊蛋白和錯誤折疊蛋白生成增多超過閾值，最終產生內質網應激反應(ERS)。李煥春等人曾提出，ERS 不僅是細胞抵抗應激的重要機制，更是應激細胞發生損傷的重要原因。適度的內質網應激利于細胞生理機能的發揮，然而當應激強度過高時，細胞會通過啟動各種信號機制引發細胞凋亡［7］。符民桂等研究者認為，一般而言，內質網與細胞凋亡的關系主要表現在兩個方面:一個是對Ca2+的調控，另一個就是內質網應激反應［8］。當然在ERS 誘導的細胞凋亡途徑中Ca2+也仍然發揮著重要的媒介作用，在受Ca2+信號調節的鈣調神經磷酸酶(CaN)、鈣蛋白酶(m－Calpain)、Caspase－12 以及Caspase－3 等分別構成了ERS 介導凋亡的下游凋亡分子事件，運動應激對這些分子事件的影響一定程度上反映了運動與細胞凋亡之間的關系(如圖1)。

圖1 內質網應激反應介導的細胞凋亡示意圖

李愛玲等人的研究指出，CaN 是迄今發現的唯一受Ca2+/鈣調素(CaM)調節的絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶，是細胞信號傳遞中的效應酶和調節酶，在骨骼肌等組織細胞中作為Ca2+信號下游的一種效應分子參與多種受Ca2+信號調節的細胞事件，CaN 的激活往往意味著［Ca2+］的升高［9］。本實驗結果顯示，與C 組相比，E組和R 組小鼠骨骼肌中CaN 的活性均顯著性升高(P〈0.05)，表明無論是有氧運動還是抗阻運動都可能造成內質網中Ca2+過度升高進而誘導內質網應激反應，使得Ca2+從內質網中被釋放入細胞質激活CaN。此外，鈣蛋白酶(Calpain)是一種Ca2+依賴性的半胱氨酸蛋白酶，其非組織特異性Calpain 主要有μ－Calpain和m－Calpain 兩種形式，二者除活化時需要的Ca2+不同以外，生化和催化的性質幾乎完全相同。Saido 等人的研究認為，由于細胞內Ca2+的波動在微摩爾(μmol)濃度水平以下，所以μ－Calpain 很可能在正常生理條件下發揮功能，而m－Calpain 則主要在生理異常甚至病理情況(如細胞內鈣超載條件)下才能激活［10］，因此，本實驗主要針對小鼠骨骼肌中m－Calpain 進行了檢測，結果發現E 組和R 組小鼠骨骼肌中m－Calpain mRNA 表達均較C 組顯著升高(P〈0.05)，意味著兩種形式的運動均能夠在引發內質網應激反應釋放Ca2+的同時促進內質網附近的m－Calpain 的表達。

Xu 等研究認為，m－Calpain 表達的上調只是ERS介導的凋亡途徑中的一個中間信號事件，當m－Calpain 被激活后，它將繼續作用于其底物(如Bax、Bid、Caspase－12)而導致細胞凋亡，其中在后續凋亡過程中起重要作用的是定位于內質網外膜的Caspase－12，它在死亡受體或線粒體凋亡途徑中始終處于失活狀態，Caspase－12 表達的增加將意味著運動應激誘發的凋亡信號能夠通過ERS 途徑來引發凋亡［11］。本實驗結果顯示，與C 組相比，E 組和R 組小鼠骨骼肌中Caspase－12 mRNA 表達均顯著升高(P〈0.05)，表明m－Calpain 被激活后確實將凋亡信號傳遞至ERS介導的凋亡途徑中特異凋亡因子－Caspase－12。那么如果再經由Caspase－12 引發凋亡主效應因子—Caspase－3 的表達上調，就會導致蛋白降解誘發細胞凋亡。

然而出乎意料的是，與C 組相比，E 組和R 組小鼠骨骼肌中Caspase－3 mRNA 表達均未呈現出促凋亡的上調趨勢，尤其在R 組Caspase－3 mRNA 表達反而有所下降，且具有顯著性差異(P〈0.05)，而E 組Caspase－3 mRNA 表達則未見任何顯著性變化(P〉0.05)。無論E 組還是R 組之所以未能呈現出預期的上調表達，究其原因可能在于Caspase－3 是多條凋亡通路的交叉點，由另外兩條凋亡途徑中的某一條途徑或者兩條途徑同時所引發的細胞凋亡在Caspase－3這一交叉點上發生了效應迥異的分子事件，而ERS 介導的細胞凋亡在Caspase－3 基因的最終表現上由于其促凋亡效應被抵消等原因使得Caspase－3 在整體效應上有所保留，最終呈現一定的凋亡隱性表征。

4 結語

綜上所述，雖然運動應激能夠引發小鼠骨骼肌內質網產生應激反應，但是并未能夠將由應激反應引發的凋亡作用最終級聯放大在Caspase－3 上得以顯性表征，導致骨骼肌細胞凋亡的必然發生，甚至對于抗阻運動而言，反而表現出一定的抑制凋亡趨勢。此外，在運動與骨骼肌細胞凋亡各凋亡途徑的關系中，內質網介導的應激反應途徑較之于原有兩條經典凋亡途徑在致凋亡的作用上可能存在一定的弱勢效應。盡管如此，相信隨著今后相關研究的逐步深入，ERS 介導的凋亡途徑仍將為我們提供一個獨特的視角來了解運動與骨骼肌細胞凋亡的關系。

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