Apollon反義核酸促進肝癌HepG2細胞凋亡機制的探討

黎毓光，何金花，王 莉，謝杏儀，陳順儀，陳武嘉，黃國賢

(廣州市番禺區中心醫院檢驗科，廣東廣州511400)

凋亡抑制蛋白(inhibitor apoptosis protein，IAP)最早從桿狀病毒中分離，此后在酵母、昆蟲、人和其他哺乳動物組織中都有發現，是近年來發現的具有抗凋亡作用的蛋白家族。目前共發現IAP 家 族 中 有 XIAP、c-IAP1、c-IAP2、NIAP、Apollon、Livin、Survivin、ILP-2 等 8 個 成員［1］。Apollon/BRUCE是IAP家族中最大的蛋白，相對分子質量為530×103，含有4 830個氨基酸，是高爾基體外膜蛋白，具有一個桿狀病毒IAP重復序列(BIR)結構域及一個泛素結合酶(ubiquitin conjugating enzyme，UBC)結構域。其中BIR結構域位于IAP的氨基端，是其抑制半胱氨酸蛋白酶(Caspase)活性、抗凋亡的重要結構;UBC結構域位于羧基端，能夠加強Apollon的抗凋亡作用。Apollon在人體多種惡性腫瘤中高表達［2］。在前期的研究中，我們篩選出的 IAP家族 Survivin、XIAP、Apollon和 Livin反義核酸(antisense oligodeoxynucleotide，ASO)能抑制人消化系腫瘤細胞增殖并促進凋亡［3］。本研究重在探討Apollon ASO促進肝癌細胞凋亡及其機制，期望為肝癌的靶向基因治療提供試驗依據。

材料和方法

一、主要試劑

DMEM/F12培養基購自Gibco公司，脂質體LipofectamineTM2000購自 Invitrogen公司，CCK-8(Cell Count Kit-8)試劑購自日本同仁化學研究所。細胞色素C單克隆抗體(cell signaling公司)，RIPA細胞裂解液(上海申能博彩生物科技有限公司)，二辛可酸蛋白測定試劑盒(北京博奧森生物技術有限公司)，鼠抗beta-actin多抗(武漢博士德生物工程有限公司)，電化學發光試劑盒(碧云天生物技術研究所)。

二、ASO

Apollon ASO(序列 5'-AGCCGCAGCCGCCA TCTTCCG-3')、隨機序列反義核酸(random oligodeoxynucleotide，RODN，序 列 5'-GAGTCGGGA GTCCGATGGCA-3')由北京賽百盛生物工程技術服務有限公司合成，全硫代修飾，聚丙烯凝膠電泳純化，凍存于-20℃，使用前用無血清的DMEM/F12培養液配制成100 μmol/L的濃度備用。

三、細胞培養及轉染

人肝癌HepG2細胞由暨南大學生化教研室惠贈。細胞培養體系:DMEM/F12培養液含10%新生牛血清，置37℃ 5%CO2培養箱，每2～3天用0.25%胰蛋白酶消化傳代培養。試驗選用對數生長期、臺盼藍拒染率＞95%的細胞。試驗時按照脂質體 LipofectamineTM2000(μL)∶ASO(μg)為2.5∶1的比例配制。先用無血清DMEM/F12培養液分別將脂質體和ASO稀釋至等體積，室溫孵育5 min，然后將脂質體與ASO在室溫下混合20 min，再將混合物逐滴加入細胞培養板中。

四、WST-8法檢測Apollon ASO對HepG2細胞的增殖抑制

取對數生長期 HepG2細胞，用無血清的DMEM/F12培養液調細胞濃度為4×104個/mL，接種96孔板，每孔100 μL，設對照組、ASO 組(終濃度0.05、0.10、0.15、0.20 μmol/L)、RODN 組(終濃度0.20 μmol/L)，48 h后每孔加入 CCK-8試劑10 μL，室溫溫育90 min，多功能酶標儀(Bio-Rad)測定吸光度(A)值(激發波長450 nm，參比波長655 nm)，計算細胞的增殖抑制率。增殖抑制率=(對照組A值-試驗組A值)/對照組A值×100%。

五、Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測細胞凋亡

以1.0×106/孔的密度將人HepG2細胞接種12孔培養板，1 mL/孔，12 h后加入藥物，設3組即對照組、RODN 組(終濃度 0.20 μmol/L)、ASO組(終濃度 0.05、0.10、0.15、0.20 μmol/L)，培養48 h后消化收集細胞，采用試劑盒提供的染色緩沖液重懸，加入FITC-AnnexinV試劑和 PI試劑，避光孵育15 min，加入200 μL染色緩沖液，流式細胞儀檢測各組細胞早期凋亡率，試驗重復3次，計算均值。

六、Hochest 33258染色觀察凋亡細胞形態學變化

以1.0×106/孔的密度將人HepG2細胞接種于12孔板，總體積1 mL，12 h后加入藥物，設3組即對照組、RODN組 (終濃度0.20 μmol/L)、ASO組(終濃度0.20 μmol/L)，培養48 h后消化收集細胞，磷酸鹽緩沖液離心洗2次，涂片，室溫干燥，甲醇-冰醋酸 (3∶1)固定15 min，晾干后于暗處用Hochest33258染色10 min，雙蒸水沖洗，甘油封片，熒光顯微鏡觀察。

七、線粒體膜電位檢測

以1.0×106/孔的密度將人HepG2細胞接種于12孔板，總體積1 mL，12 h后加入藥物，設3組即對照組、RODN組 (終濃度0.20 μmol/L)、ASO組(終濃度0.20 μmol/L)，培養48 h后消化收集細胞，磷酸鹽緩沖液洗滌，取500 μL JC-1工作液將細胞懸浮，置37℃ 5%CO2培養箱中孵育20 min后，孵育緩沖液洗2次，取500 μL孵育緩沖液重懸細胞，滴1滴細胞懸液于載玻片上，蓋上蓋玻片，于熒光顯微鏡下觀察。

八、實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)

以1.0×106/孔的密度將人HepG2細胞接種于12孔板，總體積1 mL，設3組即對照組、RODN組(終濃度 0.20 μmol/L)、ASO 組(終濃度0.05、0.10、0.15、0.20 μmol/L)，12 h 后加入藥物，培養48 h消化收集各組細胞，Trizol試劑提取RNA。采用 M-MLV逆轉錄酶逆轉錄為 cDNA。作為PCR的模版，Apollon上游引物 5'-CCAAA GGTGGTGAGCTTCA-3'，下游引物 5'-TCTACC CAGCATGGAGGAAC-3'，擴增片段大小 214 bp。GAPDH上游引物5'-AGTGCCAGCCTCGTCTC ATA-3'，下游引物 5'-TTGAACTTGCCGTGGG TAGA-3'，擴增片段大小296 bp。取模板DNA采用SYBRgreen摻入法進行熒光定量PCR，條件如下:95 ℃ 15 s預變性，95 ℃ 4 s，60 ℃ 15 s，72 ℃15 s，共45個循環。所有樣本檢測均包含一個不加模板的陰性對照，以排除假陽性結果。計算參照文獻［4］運用2-△△Ct值來比較對照組和試驗組的目的基因mRNA相對表達量的差異。

九、Caspase-3、Caspase-9 活性測定

以1.0×106/孔的密度將人HepG2細胞接種于12孔板，總體積1 mL，設3組即對照組、RODN組(終濃度0.20 μmol/L)、ASO 組(終濃度0.05、0.10、0.15、0.20 μmol/L)，12 h 后加入藥物，培養48 h消化收集各組細胞。按細胞裂解液(RIPA)說明書提取細胞蛋白。用二辛可酸蛋白定量試劑盒進行蛋白定量，根據定量結果對各蛋白質樣本進行校正，并調整蛋白濃度為2.0 μg/μL。每孔吸取50 μL含100 μg蛋白的細胞裂解液上清，同時取50 μL Lysis Buffer作為空白對照，每50微升2×Reaction Buffer加入0.5 μL二硫蘇糖醇，每孔吸取50 μL已配制 2 ×Reaction Buffer，再加入5 μL Caspase-3 Substrate 或 Caspase-9 Substrate，37℃避光溫育4 h，酶標儀測定A405mm。

十、蛋白免疫印跡技術檢測細胞內蛋白的相對表達水平

以1.0×106/孔的密度將人HepG2細胞接種于12孔板，總體積1 mL，設3組即對照組、RODN組(終濃度 0.20 μmol/L)、ASO 組(終濃度0.05、0.10、0.15、0.20 μmol/L)，12 h 后加入藥物，培養48 h消化收集各組細胞。按RIPA說明書提取細胞蛋白。用二辛可酸蛋白定量試劑盒進行蛋白定量，根據定量結果對各蛋白質樣本進行校正。加入樣本溶解液和樣本，置沸水中煮5 min。不連續的聚丙烯酰胺凝膠電泳(10%聚丙烯酰胺分離膠和5%聚丙烯酰胺濃縮膠)，電壓80 V，進入分離膠后改為120 V，40 min。將凝膠上的蛋白條帶轉到硝酸纖維素膜上，半干式轉膜15 V 18 min;TBST洗膜5 min，5%牛血清白蛋白封閉緩沖液室溫封閉1 h，TBST洗膜3次，每次5 min。4℃過夜孵育一抗。TBST洗膜3次，每次5 min。37℃孵育二抗1 h。TBST洗膜3次，每次5 min。加入電化學發光試劑，顯影。BI-2000型圖像分析軟件分析細胞色素 C和 GAPDH的積分光密度，以GAPDH作為內參。

十一、統計學方法

結 果

一、Apollon ASO對HepG2細胞增殖的影響

Apollon ASO作用于HepG2細胞48 h后，在ASO組中，0.05 μmol/L的Apollon ASO可抑制細胞的增殖，隨著ASO濃度的增高，對細胞的增殖抑制率增加，并呈劑量依賴性;與RODN組比較，差異均有統計學意義(P＜0.05)。見圖1。

圖1 不同濃度Apollon ASO對HepG2細胞增殖抑制的比較

二、Apollon ASO誘導HepG2細胞凋亡

Apollon ASO作用于HepG2細胞48 h后，與RODN組及對照組比較，ASO組的早期凋亡率明顯增高 (P＜0.05)，且存在劑量-效應關系。當ASO濃度為0.20 μmol/L時，HepG2細胞早期凋亡細胞率為29.3% ±0.46%。見圖2、3。

圖2 不同濃度Apollon ASO誘導HepG2細胞早期凋亡流式圖

圖3 不同濃度Apollon ASO誘導HepG2細胞早期凋亡率的比較

三、凋亡細胞形態學變化

Apollon ASO作用于HepG2細胞48 h后，對照組細胞形態完整，呈低強度熒光;RODN組與對照組相比未見明顯差異;而ASO組呈高強度熒光，細胞可見核固縮、邊聚、裂解等細胞凋亡形態學變化。見圖4。

四、線粒體膜電位變化

細胞發生凋亡時，線粒體跨膜電位被去極化，JC-1從線粒體內釋放，線粒體內紅光強度減弱(590 nm)，以單體的形式存在于胞液內而發綠色熒光(527 nm)。因此在雙色濾光片下觀察，正常細胞為高綠高紅，凋亡細胞為高綠低紅。RODN組與對照組細胞相似，都表現為++綠++紅(即高綠高紅)，而ASO組細胞表現為++綠+紅(即高綠低紅)。見圖5。

五、Apollon mRNA的相對表達水平

Apollon基因PCR產物的熔解曲線峰值在78℃，GAPDH的峰值在85℃。熔解曲線分析可見只有單峰值，排除了非特異性擴增。Liva等［4］設計了一種比較閾值法來測定目的基因的相對表達量 (目的基因的相對表達量 =2-ΔΔCt)。Ct值的含義是:每個反應管內的熒光信號到達所設定的閾值時所經歷的循環數，ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct管家基因)試驗組-(Ct目的基因-Ct管家基因)對照組，表示基因的差異表達倍數。不同濃度Apollon ASO作用HepG2細胞48 h后，均具有下調其mRNA表達水平的作用。目的基因mRNA的相對表達量隨用藥濃度的增加而減少，具有劑量-效應關系。見圖6。

圖4 Apollon ASO誘導HepG2細胞早期凋亡的形態學變化(×40)

圖5 Apollon ASO作用于HepG2細胞線粒體膜電位的變化(×100)

圖6 不同濃度Apollon ASO組細胞內Apollon mRNA相對表達水平的比較

六、Caspase-3、Caspase-9 活性

Caspase-3、Caspase-9在正常狀態下以酶原的形式存在于胞漿中，沒有活性，但在細胞發生凋亡階段被激活，裂解相應的胞漿胞核底物，最終導致細胞凋亡。隨著 ASO濃度的增高，Caspase-3、Caspase-9的活性明顯增高，與對照組和RODN組比較，差異具有統計學意義(P＜0.05)。見圖7。

七、細胞色素C蛋白的相對表達水平

Apollon ASO作用于HepG2細胞48 h后，隨著Apollon ASO濃度的增加，細胞色素C蛋白表達水平也增加，表明Apollon ASO促進肝癌細胞凋亡活化了細胞色素C。見圖8。

圖7 不同濃度Apollon ASO組細胞內Caspase-3、Caspase-9活性的比較

圖8 不同濃度Apollon ASO組細胞內細胞色素C蛋白相對表達水平的比較

討 論

Apollon/BRUCE的抑制凋亡機制尚不十分清楚。有研究發現Apollon主要通過結合Smac、HtrA2以及Caspase等3種機制發揮其抑制凋亡的作用［5］。Sokka等［6］在離體和在體培養的海馬神經元細胞培養中發現，Apollon表達水平被紅藻氨酸迅速下調。Caspase-3活化、Apollon表達下降，導致神經元細胞死亡。Apollon在紅藻氨酸導致的神經退行性病變中起作用，紅藻氨酸通過下調 Apollon的表達啟動細胞死亡。Lopergolo等［7］發現，靶向 Apollon的 siRNA誘導乳腺癌細胞凋亡與P53穩定性、Caspase-3活性相關。Qiu等［8］發現，Nrdp1/FLRF是一個含有RING環的泛素連接酶，Nrdp1與 BRUCE/Apollon有關。Apollon含有泛素載體蛋白 E2結構域。E2、UbcH5c、Nrdp1催化 Apollon泛素化。Apollon抑制細胞凋亡。RNAi技術抑制Apollon表達，促進細胞凋亡，Apollon將成為腫瘤治療的靶點［9］。

細胞色素C是第1種被發現的線粒體釋放的促凋亡蛋白。細胞色素C與凋亡蛋白酶活化因子(apoptotic prafease activating factor-1，APaf-1)以2∶1的比例結合，形成細胞色素 C/APaf-1復合體。該復合體可使無活性的Caspase-9原發生自身活化，繼而形成細胞色素 C/APaf-1/Caspase-9復合體。此復合體繼續作用于下游的Caspase-3活化。活化的Caspase-3可以作用于胞質中的細胞骨架蛋白，或作用于細胞核中DNA酶，引起 DNA 斷裂，引發凋亡［10］。為了探討Apollon ASO促進肝癌細胞凋亡的機制，本研究運用Apollon ASO作用于肝癌細胞48 h后，通過熒光染色觀察線粒體膜電位改變，比色法測定Caspase-3與Caspase-9的活性及蛋白質免疫印記技術檢測細胞色素C的蛋白表達水平。結果顯示，Apollon ASO組細胞發生凋亡時，線粒體跨膜電位被去極化，熒光減弱;而 Caspase-3與Caspase-9活性明顯增強，細胞色素C蛋白水平表達也增加。本研究結果表明，Apollon ASO促進肝癌細胞發生凋亡可通過線粒體介導的途徑，是否通過其他途徑，還需進一步試驗驗證。

近年來，新的靶向治療藥物及反義技術的應用已經為肝癌的治療開辟了新的前景。反義技術的基本原理就是根據堿基互補原則，用人工合成或生物體表達的特定互補的DNA或 RNA片段(ASO)抑制或封閉專一靶基因表達［11］。本研究運用IAP家族中的Apollon ASO轉染肝癌HepG2細胞，結果表明Apollon ASO通過下凋 Apollon mRNA基因來抑制肝癌HepG2細胞增殖，并通過線粒體介導的途徑促進其凋亡。但本研究只采用一株肝癌細胞為試驗對象，存在一定的局限性，在今后的試驗中我們將繼續采用不同的肝癌細胞株作為研究對象，進一步研究 Apollon ASO與Apollon siRNA促肝癌細胞凋亡及機制，期望Apollon為肝癌的治療提供一個新的靶點。

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