碳青霉稀類耐藥肺炎克雷伯菌耐藥機制和多位點序列分型研究

彭乃杰， 林哈妮， 夏 菲， 李克誠， 張 青， 葛少紅

(瑞安市人民醫院檢驗科，浙江瑞安325200)

碳青霉烯類抗菌藥物被認為是為數不多的可有效治療高產 AmpC酶和超廣譜 β-內酰胺酶(ESBLs)多重耐藥菌引起的嚴重感染的藥物之一。然而，隨著碳青霉烯類藥物在臨床中的大量、廣泛應用，碳青酶烯類耐藥的腸桿菌科細菌不斷增加。其機制主要是細菌產生的碳青霉烯酶能夠水解碳青霉稀類抗生素。肺炎克雷伯菌產生碳青霉烯酶主要為產KPC酶。KPC是一種質粒介導的Ambler分類B類酶，能水解幾乎所有的β-內酰胺酶和碳青霉稀類抗菌藥物。

多位點序列分型(MLST)通過測序來揭示保守基因的等位基因突變來對病原菌進行分型和鑒定。由于不同實驗室能通過網絡與基于核苷酸的DNA數據庫進行比對，且基于DNA的模式能更好的反應菌株間的遺傳變異情況，使得MLST技術在了解流行病學特征、病原菌的傳播途徑、追溯傳染源及臨床傳染性疾病診斷中發揮了重要作用。

由于本地區尚缺乏碳青霉稀類耐藥肺炎克雷伯菌的耐藥機制和分子流行病學資料。因此，我們使用MLST和Minimum spanning trees分析研究本地區碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌基因特征和遺傳性質。

一、材料和方法

1.菌株來源 收集瑞安人民醫院2010年1月至12月臨床分離的耐碳青霉烯類抗菌藥物的肺炎克雷伯菌8株。

2.儀器與試劑 Vitek2全自動微生物系統及其配套的鑒定卡(法國生物梅里埃公司)，E-test試條(瑞典AB BIODISK公司產品)。

3.菌株鑒定 分離純化菌株，采用Vitek2全自動微生物系統及其配套的鑒定卡。

4.體外藥敏試驗 藥敏試驗按照美國臨床實驗室標準化協會(CLSI)推薦紙片擴散法，藥敏紙片(頭孢唑啉、頭孢西丁、亞胺培南、阿米卡星、左氧氟沙星、復方磺胺甲噁唑、氨曲南、頭孢他啶、頭孢曲松、哌拉西林-他唑巴坦、頭孢呋辛、頭孢哌酮-舒巴坦、美洛培南、慶大霉素、環丙沙星、呋喃妥因、頭孢吡肟、頭孢噻肟)由英國OXOID公司提供。

5.E-test藥敏試驗 將0.5麥氏比濁度的實驗菌株分別均勻涂布于M-H瓊脂平板上，于平板上貼亞胺培南、美羅培南E-test藥敏紙片。根據CLSI 2010年6月更新的準則判斷結果。

4.改良Hodge試驗 將0.5麥氏比濁度的大腸埃希菌(ATCC25922)均勻涂布于M-H瓊脂平板上，再將10μg/片亞胺培南紙片貼于平板的中間，將實驗菌株分別以亞胺培南紙片為起點，沿離心方向劃線，35℃培養過夜，抑菌圈內呈矢狀者為陽性，并設陰、陽性對照。

5.PCR擴增及測序 煮沸裂解法提取實驗菌株全基因，用引物KPC-F(5'-GCTACACCTAGC TCCACCTTC-3')、KPC-R(5'-GCATGGATTACCAAC CACTGT-5')擴增blaKPC基因。循環參數:94℃預變性5 min，94 ℃ 45 s、55 ℃ 45 s、72 ℃ 45 s，30 個循環后72℃延伸10 min。擴增產物送上海生工生物有限公司測序部雙向測序。測序結果用BLAST比對(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)。

6.MLST分析 對實驗菌株的7個管家基因(rpoB、gapA、mdh、pgi、phoE、infB、tonB)參照http://www.pasteur.fr/recherche/genopole/PF8/mlst/primersKpneum oniae.html公布的通用引物及退火溫度進行PCR擴增并測序，將序列與數據庫中儲存的序列比對，確定其等位基因譜型及菌株序列型(ST型)。利用官方提供的工具生成Minimum spanning trees。

二、結果

1.菌株鑒定 采用Vitek2全自動微生物系統鑒定實驗菌株均為肺炎克雷伯菌。

2.K-B藥敏試驗 實驗菌株臨床常規藥物敏感實驗均為耐藥。

3.E-test藥敏試驗 用E-test藥敏試驗進行實驗菌株的最小抑菌濃度(MIC)測定，顯示所有菌株對亞胺培南、美羅培南耐藥，MIC均＞32 mg/L。

4.改良Hodge試驗 實驗菌株Hodge試驗均陽性。

5.PCR擴增及測序 用KPC引物擴增并電泳可見實驗菌株均有1條1 000 bp左右的條帶，見圖1。測序結果進行比對均為KPC-2。

圖1 bla KPC PCR產物

6.MLST分析 MLST顯示有4種ST型，流行型為ST-11(5/8)，此外 ST-494、ST-15、ST-258各1株，見表1。

表1 MLST和KPC結果

三、討論

碳青霉烯酶是指能夠明顯水解至少一種碳青霉烯類抗菌藥物的一類β內酰胺酶，腸桿菌科細菌產生碳青霉烯酶是其對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的主要機制。在浙江瑞安地區2010年總共分離出了8株碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌，經紙片擴散法和E-test測定均對亞安培能和美羅培南耐藥。經PCR擴增和測序表明其耐藥機制均為產KPC-2型碳青霉烯酶，和文獻［1-4］報道一致。

最近，ST-258型的產KPC肺炎克雷伯菌作為一種主要的分子流行克隆型被全球廣泛報道。本研究結果顯示在瑞安地區ST-11為產KPC肺炎克雷伯菌中主要的克隆型(5/8)，與文獻［4］報道的一致。ST-11與ST-258只有一個單基因位點變異(ton B)，這表明他們之間密切相關。ST-11和ST-258屬于同一個克隆復合體CC258，這個復合體包括了 ST-11、ST-258和其他 5個 ST型(ST270、ST340、ST379、ST407和 ST418)。CC258與耐萬古霉素腸球菌(VRE)的CC17及耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌(CRAB)的CC22以同一種方式廣泛傳播。ST-11可能是產KPC酶肺炎克雷伯菌的另一種優勢克隆型。由此可以推斷有些ST型(ST-11和ST-258)可能比較容易在質粒存留，使這些菌株在人群中傳播。

另外，ST-15與ST-14有一個單基因位點變異(inf B)，可能屬于另一個克隆復合體。ST-15可能只在美國中西部地區局限型傳播［5］。在國內，杭州一家醫院有報道過一例［4］。本研究中有一株ST-15，屬于散發流行。2011年希臘首次報道了ST-494［6］，本研究中ST-494為國內首次報告。

在國內，產KPC酶肺炎克雷伯菌以前只在少數地方報道過，現在已經全國流行。瑞安地區產KPC酶肺炎克雷伯菌也越來越多的被發現。產KPC酶肺炎克雷伯的蔓延令人擔憂。因此，我們應認真關注這一問題，密切監測和采取嚴格的感染控制措施來控制醫院感染。

［1］朱健銘，劉國慶，姜如金，等.多藥耐藥肺炎克雷伯菌β-內酰胺類耐藥機制研究［J］.中華醫院感染學雜志，2012，22(4):674-678.

［2］Wei ZQ，Du XX，Yu YS，etal.Plasmid-mediated KPC-2 in a Klebsiella pneumoniae isolate from China［J］.Antimicrob Agents Chemother，2007，51(2):763-765.

［3］馮雅君，沈 萍，杜小幸，等.產碳青霉烯酶KPC-2肺炎克雷伯菌局部流行［J］.浙江醫學，2008，30(9):923-925.

［4］Qi Y，Wei Z，Ji S，etal.ST11，the dominant clone of KPC-producing Klebsiella pneumoniae in China［J］.JAntimicrob Chemother，2010，66(2):307-312.

［5］Kitchel B，Rasheed JK，Patel JB，etal.Molecular epidemiology of KPC-producing Klebsiella pneumoniae isolates in the United States:clonal expansion of multilocus sequence type 258［J］.Antimicrob Agents Chemother，2009，53(8):3365-3370.

［6］Giakkoupi P，Papagiannitsis CC，Miriagou V，etal.An update of the evolving epidemic of blaKPC-2-carrying Klebsiella pneumoniae in Greece(2009-10)［J］.J Antimicrob Chemother，2011，66(7):1510-1513.