聚乙二醇沉淀法與凝膠色譜層析法檢測巨泌乳素的相關性研究

王 霞， 劉金玲， 高 碩

(1.天津市血液中心，天津300110;2.天津市醫科大學總醫院，天津300052)

泌乳素(prolactin，PRL)是垂體前葉分泌的一種多肽類激素。PRL的正確檢測關系到臨床正確診斷、合理治療和預后的判斷。文獻報道［1-2］巨泌乳素(macroprolactin，MPRL)的存在是導致高PRL的重要原因之一。MPRL能被某些免疫檢測儀誤認為PRL報告給臨床，給高泌乳素血癥(hyperprolactinemia，HPRL)的診斷帶來很大干擾。如何排除干擾，提高PRL檢測的準確性已成為臨床和實驗室關注的重點。

目前，凝膠色譜層析(gel filtration chromatograpy，GFC)法被公認為檢測MPRL的金標準［3］，但因檢測技術較復雜，檢測時間長且費用昂貴而不適合臨床常規篩查。相比較而言，聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)沉淀法經濟、簡便、易行。我們對PEG沉淀法與GFC法進行比較，初步探討PEG沉淀法檢測MPRL的可行性。

材料和方法

一、標本來源

選自2009年1月至2010年1月就診于天津醫科大學總醫院婦產科及內分泌科的HPRL患者26例，均為女性，年齡18～46歲。所有標本經Bayer ACS180化學發光免疫分析儀測定血清PRL后，留取血清－70℃保存待檢，同時搜集該病例的臨床診斷及影像學資料，根據臨床診斷、影像學資料及實驗室檢測分為真性HPRL組(簡稱真泌組)11例及MPRL血癥組(簡稱巨泌組)15例。

二、GFC法分離血清PRL

1.凝膠色譜柱 規格1.6 cm×80 cm凝膠色譜柱購自天津嘉悅玻璃制品有限公司。

2.填充介質 Sephadex G100購自美國法瑪西亞生物有限公司。

3.組分定標 蘭葡聚糖(相對分子質量2.5×103)，乙醇脫氫酶(相對分子質量150×103)，牛血清白蛋白(相對分子質量66×103)，碳酸酐酶(相對分子質量29×103)，以上標準品均購自美國Sigma-aldrich公司。根據定標體積收集目標組分。

4.洗脫緩沖溶液配制 10 mmol/L Tris緩沖液(pH 值 7.4)，含 10 mmol/L Tris、140 mmol/L NaCl、1.25 mmol/L CaCl2、0.5 mmol/L MgCl2及0.02%NaN3。使用前用0.4 μm 濾膜抽濾，4 ℃保存待用。

5.儀器 BS-100A型自動部分收集器及自動恒流泵均購自上海滬西分析儀器有限公司。UV-2501型紫外分光光度檢測儀購自日本島津公司。

6.標本預處理 血清自－70℃取出融化后平衡至室溫，混勻后2 000×g離心10 min，取血清中段，用0.2μm濾膜過濾，吸取血清待用。

7.GFC法上機分離參數 流速0.5 mL/min，上樣量1.0 mL。洗脫相為10 mmol/L Tris緩沖液(pH 值7.4)。

8.收集組分 每收集1.5 mL為一管，每份標本收集100管，經Bayer ACS180化學發光免疫分析儀檢測PRL濃度。將檢測結果錄入EXCEL表格并繪制PRL層析圖。

三、PRL及MPRL檢測

1.PRL檢測 Bayer ACS180化學發光免疫分析儀及其配套試劑均購自美國拜耳公司，高、中、低值質控品均購自美國伯樂公司。PRL檢測靈敏度為0.3 ng/mL，批內變異系數(CV)為2.5%～3.8%，批間 CV為3.6%～4.5%。

2.MPRL篩查 25%PEG(相對分子質量為6 000)購自北京鼎國生物技術有限公司，溶液4℃保存用作 MPRL的沉淀劑。AllegraTMCentrifuge超速冷凍離心機購自美國貝克曼公司。

3.MPRL篩查方法 每份血清取250μL，加等量的25%PEG溶液，充分混勻后室溫放置30 min，4℃ 2 000×g離心30 min，取上清液分別檢測PRL值。PRL測定回收率=［(PEG沉淀后PRL值×2)/PEG沉淀前PRL值］×100%，回收率≤40%提示該標本含有MPRL［4-6］。

四、統計學分析

采用SPSS11.5軟件進行統計處理。因數據呈偏態分布，故采用中位數(P2.5～P97.5)表示。多組數據比較采用Wilcoxon符號秩檢驗，組間比較采用非參數Kruskal-Wallis H檢驗，線性回歸分析采用Spearman相關系數。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、GFC法分離MPRL與真性HPRL的PRL層析譜

混合標準品分離結果見圖1。根據目標PRL相對分子質量大小，依據定標體積收集相應組分。MPRL血癥色譜分離結果見圖2，HPRL色譜分離結果見圖3。

圖1 GFC法混合標準品分離結果

圖2 GFC法分離MPRL血癥各組分PRL

圖3 GFC法分離HPRL各組分PRL

二、真泌組與巨泌組PEG處理前、后PRL濃度比較

真泌組與巨泌組血清處理前總PRL濃度差異無統計學意義(P=0.113)，而處理后真泌組明顯高于巨泌組(P＜0.05)，結果見表1。

表1 真泌組和巨泌組PEG處理前、后PRL濃度比較 (ng/mL)

三、GFC法與PEG沉淀法檢測真泌組與巨泌組單體PRL濃度的比較

采用GFC法與PEG沉淀法檢測真泌組和巨泌組單體PRL濃度差異無統計學意義(P＜0.05)，結果見表2。

表2 GFC法與PEG沉淀法檢測真泌組與巨泌組單體PRL濃度 (ng/mL)

四、GFC法與PEG沉淀法檢測真泌組與巨泌組單體PRL回收率比較

GFC法與PEG沉淀法檢測真泌組與巨泌組單體PRL回收率差異無統計學意義(P＞0.05)，結果見表3。

表3 GFC法與PEG沉淀法檢測真泌組與巨泌組單體PRL回收率 (%)

五、GFC法與PEG沉淀法檢測26例HPRL血清單體PRL的相關性比較

PEG沉淀法與GFC法的相關性良好［相關系數(r)=0.844，P=0.000］，見圖4。

圖4 GFC法與PEG沉淀法檢測單體PRL的相關性比較

討 論

垂體前葉嗜酸性細胞合成的PRL含有199個氨基酸，其中包括6個半胱氨酸。經GFC法確認，主要存在3種不同相對分子質量的PRL，即有活性的23×103的單體PRL、無或低生物活性而有免疫反應性的(45～60)×103的大PRL及＞100×103的 MPRL。正常人血清中單體 PRL約占85%～95%，MPRL 僅約占1%［7］。

GFC法作為MPRL血癥經典的確證試驗，最大的優點是能很好的區分MPRL、大PRL及單體PRL，直接證明血清中MPRL的存在，并能通過色譜洗脫曲線峰下面積計算PRL各種分子形式的比例和含量。

本研究中真性HPRL患者與MPRL患者血清總PRL濃度在PEG處理前差異無統計學意義(P=0.113)，表明MPRL血癥與真性HPRL在生化指標上很難區分，而PEG處理后真泌組明顯高于巨泌組(P＜0.05)，提示MPRL具有免疫反應性，對某些檢測系統免疫檢測造成干擾［8］。本研究利用GFC法證實的MPRL血癥與真性HPRL患者單體PRL比例不同，真性HPRL中單體PRL占46.12%～81.73%，MPRL血癥中單體 PRL僅占7.43%～35.95%，二者比較有明顯差異(P=0.000)。

本研究表明PEG沉淀法與GFC法具有良好的相關性(r=0.844，P=0.000)，與Lucille 等［3］報道的研究結果相一致(r=0.80)，且本研究結果也表明PEG沉淀法具有良好的穩定性。

Quinn等［9］報道在PRL增高患者中有25%存在MPRL，真性HPRL和MPRL血癥不能僅僅根據臨床表現區分。因此，正確診斷HPRL，避免不必要的檢查和不恰當的治療、隨訪，對PRL增高的患者進行篩查是有必要的。盡管GFC法是檢測MPRL的金標準［10］，但由于技術復雜、檢測時間長、費用昂貴，限制了其在實驗室中的常規使用。本研究對PEG沉淀法與GFC法進行方法學比較，初步結果表明PEG法與GFC法具有良好的相關性，且簡便、易行。可考慮作為實驗室MPRL血癥的常規篩查方法。

［1］方 軍，潘恩云.高泌乳素血癥患者篩查巨泌乳素的臨床意義［J］.檢驗醫學，2011，26(10):686-688.

［2］姜躍偉，奚經巧，朱詩呈，等.用聚乙二醇沉淀法篩查高泌乳血癥的應用評價［J］.檢驗醫學，2009，24(4):268-270.

［3］Kavanagh L，McKenna TJ，Fahie-Wilson MN，etal.Specificity and clinical utility of methods for the detection of macroprolactin［J］.Clin Chem，2006，52(7):1366-1372.

［4］Fahie-Wilson M，Brunsden P，Surrey J，etal.Macroprolactin and the Roche Elecsys prolactin assay:characteristics of the reaction and detection by precipitation with polyethylene glycol［J］.Clin Chem，2000，46(12):1993-1995.

［5］Leslie H，Courtney CH，Bell PM，etal.Laboratory and clinical experience in 55 patients with macroprolactinemia identified by a simple polyethylene glycol precipetation method［J］.J Clin Endocrinol Metab，2001，86(6):2743-2746.

［6］Fahie-Wilson MN，Soule SG.Macroprolactin aemia:contribution to hyperprolactinaemia in a district general hospital and evaluation of a screening test based on precipitation with polyethylene glycol［J］.Ann Clin Biochem ，1997，34(Pt 3):252-258.

［7］Sadideen H，Swaminathan R.Macroprolactin:What is it and what is its importance［J］.Int J Clin Pract，2006，60(4):457-461.

［8］Gibney J，Smith TP，McKenna J.Clinical relevance of macroprolactin［J］.Clin Endocrinol(Oxf)，2005，62(6):633-643.

［9］Quinn AM，Rubinas TC，Garbincius CJ，etal.Determination of ultrafilterable prolactin:elimination of macroprolactin interference with a monomeric prolactin-selective sample pretreatment［J］.Arch Pathol Lab Med，2006，130(12):1807-1812.

［10］王 霞，劉金玲，高 碩.高泌乳素血癥中巨泌乳素檢測的研究進展［J］.國際檢驗醫學雜志，2010，31(3):263-264.