蜂毒肽抗腫瘤研究新進展

■ 楊小浪 董江濤 陳文彬 繆曉青

(作者楊小浪、董江濤、陳文彬、繆曉青單位為福建農林大學蜂學學院、蜂療研究所)

蜂毒是蜜蜂工蜂毒腺分泌出來的一種具有芳香氣味成分復雜的混合物，主要含有蜂毒肽、蜂毒明肽、肥大細胞脫粒肽等多肽類；另外還有透明質酸酶、磷脂酶A2等50多種活性酶類，以及組織胺、多巴胺等生物活性物質。蜂毒中研究較多的是蜂毒肽，它是一種水溶性陽離子兩親性細胞毒肽。蜂毒肽占蜂毒比重的45～50%，是蜂毒中的主要功能物質。蜂毒肽呈堿性和正電性，易溶于水，相對分子質量為2800左右，具有消炎、降壓、鎮痛、抑制血小板凝集、抗輻射、抗菌、抗病毒(如抗HSV—l病毒、抗HIV)、抗風濕性關節炎及抗腫瘤等多種藥理活性[1-2]。近年來研究較多的抗腫瘤、抗艾滋病毒的作用，引起了人們的極大關注。

近幾年關于蜂毒肽抗腫瘤作用及其相關機理的研究很多。已有研究表明，可以有效地抑制骨肉瘤細胞、胃癌細胞SGC一7901、肺癌細胞NCI—H1299、肝癌細胞SMMC一7721，并誘導腫瘤細胞凋亡；促進IL-2生成、NK細胞增殖，誘導T細胞增殖分化，增強細胞免疫功能。因此，蜂毒肽是一個非常具有應用前景的抗腫瘤天然藥物。

但是，其臨床應用卻有很多局限，具有溶血活性，致敏反應，非特異性，非靶向毒性等可能引起的毒副作用，以及血液中的血清肽酶的裂解，降低其有效的藥理作用等。另外蜂毒肽的獲得還有一定局限性，現有的技術還難以將蜂毒中有致敏反應且與蜂毒肽分子量接近的磷脂酶A2完全去除。基因工程的出現不失為一條有效途徑。通過基因工程獲得蜂毒肽的方法已經取得一定進展，但仍有許多不足之處，距離大規模生產還有很長的一段路。

多靶點、多種機制協同作用的蜂毒肽

人類社會利用蜂毒的歷史悠久，同時人們對蜂毒和蜂毒肽的研究也在不斷深入。自從1952年Netumar等人用電泳法分離獲得蜂毒肽以來，關于蜂毒肽的研究拉開了帷幕，很多研究發現蜂毒肽對體內外多種腫瘤細胞都有殺傷作用。1972年，Habermant報道1μmol/L的蜂毒肽就能阻止腫瘤細胞增殖但卻不抑制正常細胞的生長與克隆率。1996年，Arora通過對正常大鼠肝細胞與大鼠肝癌細胞抗缺氧損傷能力的實驗對比，證實蜂毒肽激活磷脂酶A2(PLA2)能夠解除肝癌細胞對缺氧的抵抗。DUnn等將來自于鼠抗人骨髓瘤細胞和淋巴瘤細胞表面特異蛋白的抗體SCFV基因同蜂毒肽基因相融合，構建了能殺腫瘤細胞的抗毒素基因，大腸桿菌中融合基因并表達，精制的抗毒素顯示了體外殺死腫瘤細胞的效能。國內外關于蜂毒肽抗腫瘤作用研究比較多，認為其抗腫瘤作用是一個多靶點、多種機制協同作用的結果，誘導細胞凋亡、直接殺傷腫瘤細胞、抑制細胞周期、抑制血管生成、調節免疫力等相關機制各類文獻均有報道。

在細胞外就可破壞腫瘤細胞的毒性

蜂毒肽是陽離子兩親性多肽，而兩親性是膜結合肽和膜蛋白跨膜螺旋的基礎，所以具有膜活性，能直接對細胞的磷脂膜起溶解作用，破壞細胞膜而導致細胞死亡，因此它不用進入細胞，在細胞外即可顯示出其破壞腫瘤細胞的毒性。蜂毒肽與膜作用時，隨著時間的變化、四聚體衰變為穩定的三聚體和單體。這個持續的構型變化將伴隨著含水孔的橫向擴張，主要由α一螺旋之間的靜電排斥造成孔增加，因此細胞裂解。

1999年，Kubo等用5種細胞毒的測定方法對蜂毒肽與嗜酸性粒細胞的主要堿性蛋白進行比較，結果證實蜂毒肽能插入K562細胞的胞膜中進而形成孔道，引起Ca2+內流使胞內Ca2+濃度升高，細胞裂解，最后導致在lh內蜂毒肽對實驗的白血病細胞均具殺傷效果。2008年，Van den Bogaart G等關于蜂毒肽對細胞膜的鉆孔機理的研究，提出了蜂毒肽對兩親性磷脂體組成的細胞膜同時存在著兩種作用模式：鍵合和鉆孔，而且這兩種模式互相競爭。這個與Kourie JI和Trinh LB提出的毯式和穿孔模型相吻合，蜂毒肽能直接作用于細胞磷脂膜使之裂解，從而抑制細胞生長發育。鍵合模式中蜂毒肽分子與細胞膜表面平行，鉆孔模式中蜂毒肽分子則垂直插入到細胞膜表面內。并提出了一種蜂毒肽分子對細胞膜鉆孔的兩步模型：低濃度時平行鍵合，高濃度時轉向垂直朝向(A、B中的2)，引起鉆孔。但從乎行狀態轉向垂直狀態很難被理解，因為+5價中性pH值蜂毒肽分子和磷脂體首基團有強烈的相互作用，轉變的能量很高。

另外，研究發現蜂毒肽會以同樣的方式作用于細胞內細胞器的膜，如蜂毒肽滲透線粒體膜，并使其腫脹，進一步釋放細胞色素C和誘導細胞凋亡。另有研究發現蜂毒素使細胞線粒體膜溶解，使細胞的正常呼吸受到抑制，因而腫瘤組織氧化磷酸化的過程受到抑制，氧化功能被破壞，導致腫瘤組織生長抑制。

腫瘤的發生與細胞凋亡受阻有關

細胞凋亡(Apoptosis)又稱程序性細胞死亡(Programmed Cell Death，PCD)，是細胞的一種不同于壞死的死亡方式，是細胞由基因控制的一種生理性死亡，同細胞的增殖、分化一樣，是由基因控制的主動的細胞生物學過程。而腫瘤的發生、發展不僅是細胞增殖和分化異常的結果，也與細胞凋亡受阻有關。

近幾年來，有關蜂毒及蜂毒肽抗腫瘤的機制研究取得新的進展，眾多研究發現蜂毒及蜂毒肽的抗腫瘤生物活性是通過誘導腫瘤細胞凋亡實現的，而誘導凋亡又是通過誘導相關凋亡基因和蛋白的表達實現，如通過Caspases途徑誘導細胞凋亡、Bcl-2和BaX的蛋白表達。2001年，黃雪強等通過人白血病細胞觀察蜂毒肽促凋亡的作用，結果發現對白血病細胞5 mg／mL蜂毒肽作用4 h與4μg／mL蜂毒肽作用24h都可見典型凋亡特征，進一步實驗發現其誘導細胞凋亡同bcl-2基因表達顯著下降相關。2004年，Ahn等報道，蜂毒素誘導肺癌細胞凋亡與增加Bax蛋白表達、激活半胱氨酸蛋白酶有關。2007年，張晨等研究顯示蜂毒素可誘導肝癌細胞BEL-7402線粒體膜蛋白7A6的表達和凋亡相關基因產物Fas及其配體FasL信號傳導途徑，進而促進細胞凋亡。2012年王怡蘋等認為蜂毒素誘導胃癌細胞系SGC-790l細胞凋亡的機制與調節p53、BaX和Bcl-2等相關基因的表達有關。可以看出蜂毒肽誘導腫瘤細胞凋亡與其調節相關基因及蛋白的表達有關。

另外有研究顯示通過影響細胞內轉導介質、影響細胞轉導信號以及影響細胞周期從而促進細胞凋亡。影響細胞內轉導介質方面，如對凋亡誘導劑Ca2+的影響和誘導神經酰胺合成(神經酰胺是一種新的細胞內第二信使，具有激活蛋白激酶、調節蛋白的磷酸化和影響磷脂酶A2(PLA2)活性等多種生物學功能，而且神經酰胺被認為是引起細胞生長、分化和凋亡的有效誘導劑)。影響細胞轉導信號方面，Hao等在試驗中發現MAPK通路中的FRK、P38、JNK的表達受到蜂毒肽的影響。Wang等報道蜂毒肽能夠通過活化CaMKII-TAK1-JNK／p38途徑，同時抑制IKKNF-KB途徑誘導HCC細胞凋亡，并且能夠通過此方式增強HCC細胞對凋亡誘導劑TRAIL的敏感性。蜂毒肽作用于細胞膜后觸發了PI3K—Akt和MARK—ERK等信號轉導通路，進而引起Caspase家族和bcl-2家族的變化，誘導細胞凋亡。影響細胞周期促進細胞凋亡方面，張晨等通過實驗證明蜂毒素通過減少PCNA陽性細胞的表達、影響細胞周期的比率來抑制肝癌細胞SMMC7721的生長、增殖。李玉梅等亦證明蜂毒素可減少骨肉瘤U20S細胞的PCNA陽性細胞的表達，干擾腫瘤細胞的細胞周期、阻止S期細胞進入G2／M期，造成S期細胞的聚集，進一步促進細胞凋亡。

直接作用于機體免疫抑制腫瘤血管生成

國內外有研究報道，蜂毒肽可能通過參與免疫調節和抗血管生成途徑達到抗腫瘤效應。王秋波等的研究表明，蜂療后機體血漿及誘導巨噬細胞產生的IL-2含量明顯增高，而IL-4含量無明顯變化，同時血漿中的IgG、IgA、IgM，C3的量在蜂療前后無明顯變化，證實了蜂毒肽對機體免疫系統有直接作用，蜂毒肽通過增強THl細胞功能，對機體細胞免疫功能起正向調節作用。宋長城等認為下調VEGF和bFGF的表達，進而抑制肝癌血管生成可能是其抗腫瘤作用的重要機理之一。高啟龍等在蜂毒素對骨肉瘤UMR-106細胞裸鼠移植瘤血管生成影響的試驗中證明，蜂毒素治療組VEGF、HIF-1α蛋白陽性表達率均有所降低，同時檢測到CDl05陽性率明顯降低，表明新生血管數目明顯減少。亦有實驗證明，蜂毒素可顯著抑制雞胚絨毛尿囊膜的血管生成，并且呈現濃度依賴關系。

減毒增效研究

由于蜂毒肽具有破壞細胞膜、溶血活性、致敏反應的毒副作用，以及存在易被血液中的血清肽酶的裂解而降低其藥效的問題，限制了蜂毒或蜂毒肽的臨床應用。另外其為水溶性多肽，通過口服給藥會破壞其活性。為了解決這一系列問題，國內外學者進行了相關的減毒增效研究。

化學或基因重組的蜂毒肽優化

針對蜂毒肽較差的藥代動力學和非靶向毒性，一些科學家通過化學或基因重組方法改變蜂毒肽的結構對其進行優化。1993年，Baker等通過化學方法改性陽離子兩親性多肽-Melittin，以改善其在體內的藥代動力學性質和降低毒性。Melittin由于自身存在的L-amino acids，易于被肽酶水解，這限制了蜂毒肽在血液中的半衰期，并減少了它們的口服生物利用度。因此用D-amino acids或含有不同側鏈的非天然氨基酸部分或全部取代L-amino acids，但不影響其抗腫瘤效應。另外，通過與靶向肽共軛鏈接，達到靶向組織或靶向細胞，以改變其較差的藥代動力學和非靶向毒性，如蛋白質轉導結構域，整合素受體配體和5個氨基酸的線性長肽CREKA均能選擇性地識別腫瘤血管和基質中的凝結血漿蛋白類。

通過載體介導重組基因編碼蛋白，導入腫瘤細胞，可以避免其較差的藥代動力學和非靶向毒性。1996年，Dunn領導的研究小組對蜂毒肽抗癌作用進行了研究，通過融合基因編碼并在大腸桿菌中進行表達，得到由一個肽鏈接器將蜂毒肽與scFV抗體片段結合的具有靶向腫瘤細胞的蜂毒肽(scFv-mel)，其解決了蜂毒肽的非特異性毒性，同時增加了其靶向性和抗腫瘤活性。在此基礎上研發出的以蜂毒肽為“彈頭”的抗毒素，對前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌等都具很好的療效。2008年，姬聰慧以Melittin為毒性部分，RGD(精一甘一天冬氨酸三肽)為靶向部分，通過基因重組融合表達，構建了膜毒性免疫毒素RGD—Mel，在體外表現出明顯的抗腫瘤活性。

與傳統抑癌藥物結合帶來的療效

常見的化療藥物有很強的非靶向毒副作用和產生耐藥性，因此有科學家嘗試通過傳統抗癌化療藥物與具有膜活性的陽離子兩親性細胞毒肽結合達到降低各自使用劑量，既能增加抗腫瘤效果和降低毒副作用，同時避免耐藥性問題。與蜂毒肽類似的陽離子兩親性肽如天蠶素抗菌肽與抗癌藥物氟尿嘧啶及S一阿糖胞苷、蛙皮素類似物與順鉑、阿霉素和依托泊苷協同作用都顯示了增強抗腫瘤作用和減少或避免耐藥性問題。

2006年，王居祥等報道，將蜂毒注射液與化療相結合，觀察患者近期客觀療效、臨床證候改善情況和對生活質量的影響，結果在改善臨床證候方面，聯合治療組的作用優于單純化療組與蜂毒注射液組。

應用微納米藥物傳遞系統

2001年，凌昌全等報道，將蜂毒素——泊洛沙姆407緩釋劑注入H22荷瘤小鼠瘤體內，結果證明蜂毒素緩釋制劑的毒性明顯低于單純蜂毒素，且治療后平均生存期明顯延長，綜合療效優于單純蜂毒素組。表明蜂毒素的緩慢釋放延長了其對腫瘤細胞的作用時間，增強了抗腫瘤效應，同時減輕了蜂毒素對機體的毒性，表現出明顯的減毒增效作用。

2004年，李琦等報道，采用改良的復乳-液中干燥法制備蜂毒素——聚乳酸羥乙酸微球，介入治療大鼠移植性肝癌，藥物在腫瘤局部緩慢釋放，局部藥物濃度高，全身濃度低，蜂毒素微球在抑制腫瘤生長，延長荷瘤大鼠生存時間方面明顯優于蜂毒素和空白微球，起到了很好的減毒增效作用，但其使用的是肝動脈插管法給藥，需要剖腹。

2008年，蘇永華等制備蜂毒素磁性納米制劑并作用于小鼠H22移植腫瘤，結果顯示蜂毒素磁性納米制劑對小鼠肝癌皮下瘤模型有明顯的抗腫瘤作用。2011年，代坤坤等報道以全氟碳為納米核心，通過高壓均質法制備蜂毒素納米囊，用于蜂毒肽減毒增效抗腫瘤研究。2011年，鐘鐵誠等報道了，制備載有蜂毒素的磷酸鈣納米粒用于體外抑瘤活性的研究，其釋放行為具有酸敏性特點，緩釋作用提高了抑瘤活性。

另外，華盛頓大學醫學院的Wickkline SA等相關課題組近幾年做了以蜂毒肽為代表的陽離子兩親性肽(Cytolytic peptides)減毒增效的一系列研究。該課題組制備的非靶向和整合素αvβ3靶向的全氟化碳納米粒子裝載蜂毒肽(melittin NP and αvβ3-targeted melittin NP)與單純蜂毒肽相比，明顯的降低了其對小鼠體內血細胞的溶血作用，延長了在血液中的循環時間，同時避免蜂毒肽被降解和非靶向副作用，增加了傳遞到腫瘤細胞的濃度和增強了抑制腫瘤生長的作用。

在此基礎上他們還發明了一種兩親性肽鏈接器，該鏈接器本身是一個被截斷缺失部分氨基末端的蜂毒肽片段(VLTTGLPALISWIKRKRQQ-ggVHPKQHR)，其保留膜結合性，但不具有溶解細胞性，可快速將anti-VCAM靶向肽段(靶向血管細胞粘附因子)連接到全氟化碳納米粒子(單層脂質傳遞系統)和脂質體(雙層脂質傳遞系統)藥物載體表面，靶向新生血管或癌細胞，用于針對特定病理的人或特定病例階段靈活和個性化定制藥物運輸系統。

進一步研究和完善早日造福人類

根據研究蜂毒肽雖有抗腫瘤作用，但對于具體的抗腫瘤機制還沒有一個定論。蜂毒肽本身具相對分子質量小、結構較簡單，沒有現今的一些抗癌藥物毒副作用強，且不易產生耐藥性等特點，為低毒或無毒副作用的抗腫瘤新藥研發提供了有利的條件。另一方面，其仍存在的毒副作用和較差的藥代動力學阻礙了其抗腫瘤臨床應用的開展，為了改善藥代動力學性能，降低其毒副作用，科學家們都進行了相關嘗試。

通過化學或基因重組的方法改變蜂毒肽的結構、與其他化療藥物相結合和應用各種新型的微納米藥物運輸系統靶向腫瘤組織或腫瘤細胞，以達到減毒增效和減少或避免產生耐藥性。這些嘗試較傳統的化療治療癌癥有了一定的進步性，但目前很多局限于細胞水平或在鼠體內進行研究。雖然研究顯示在改善藥代動力學，延長在血液中的半衰期，降低其非靶向性毒副作用，增強其抗腫瘤效應，都取得了很好的效果。但蜂毒肽及藥物傳遞體系在其他活體體內包括人體內的作用，如藥代動力學，生物相容性，可降解性，是否有潛在的毒副作用等方面需要進一步的研究和完善，以期早日造福人類。另外，通過基因重組的方式獲得具有靶向性的改性蜂毒肽或結合基因治療，以此降低蜂毒肽的溶血作用和非靶向毒性，同時避免耐藥性問題，仍然是未來研究蜂毒肽抗腫瘤很好的方向。

[1] 楊文超.蜂毒肽的分離純化及其抗輻射作用機理研究[D].福建農業大學碩士學位論文 2007.

[2] 張麗娟.蜂毒肽分離純化與體內外抗HSV-1病毒作用的研究[D].福建農業大學碩士學位論文，2010.