蜂膠及其活性成分抗心肌細(xì)胞氧化性損傷作用探析

■ 葛苗苗 孫麗萍 徐響 杜夏 王馨

（作者葛苗苗單位為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院；孫麗萍、徐響單位為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，農(nóng)業(yè)部國家蜂產(chǎn)品加工專業(yè)分中心；杜夏、王馨單位為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所）

蜂膠是西方蜜蜂采集植物樹脂后，混入蜂蠟和其它分泌物經(jīng)加工咀嚼而成的一種粘稠物質(zhì)。蜂膠作為一種天然活性物質(zhì)，其成分極其復(fù)雜，具有抗菌、抗氧化、抗炎、抗腫瘤等多種生物活性，是作為保健食品、藥品制品的重要活性成分。

隨著人們飲食結(jié)構(gòu)的改變、空氣質(zhì)量不斷下降以及我國老齡化現(xiàn)象的加劇，心血管疾病已逐漸成為威脅我國公民健康的重大疾病之一。心血管疾病的發(fā)病機制極其復(fù)雜，其中氧自由基引起的心肌細(xì)胞氧化性損傷是造成心血管系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與功能異常的重要原因之一。大量研究證實，許多心血管疾病的病理過程中都有過量的氧自由基產(chǎn)生，氧化應(yīng)激狀態(tài)下的活性氧自由基代謝紊亂是心肌細(xì)胞損傷甚至壞死的重要觸發(fā)因素。因此，抗心肌細(xì)胞氧化性損傷是研究心血管疾病防治的重要切入點。本文對采用不同的氧化損傷模型研究蜂膠及其活性成分對心肌細(xì)胞氧化損傷的作用進(jìn)行了總結(jié)。

抗氧化作用

蜂膠中含有多種活性成分，目前已鑒定出300多種物質(zhì)，包括黃酮類、萜烯類、芳香酸及其衍生物、氨基酸、醛酮類物質(zhì)，還有多種烴類物質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)微量元素和酶等。蜂膠中的多酚物質(zhì)極其豐富，并已鑒定出70多種黃酮類化合物，酚酸及其酯類近60種。研究表明，黃酮類物質(zhì)、萜烯類物質(zhì)和酚酸及其衍生物是蜂膠中的主要活性成分。因蜂膠黃酮結(jié)構(gòu)中具有各種不同取代位置的酚羥基、不飽和鍵等，使其具有較高的抗氧化活性。

目前，國內(nèi)外研究人員從蜂膠中分離、純化出若干組分物質(zhì)及化合物并采用體外氧化實驗研究了其抗氧化作用。Katsuhiro H 等在分離蜂膠抗氧化成分時發(fā)現(xiàn)，蜂膠抗亞油酸氧化的能力較強，成分以artepillin C的含量最高。Nagai T等的研究表明，蜂膠的黃酮類化合物具有很強的供氫能力，它的抗氧化性優(yōu)于茶多酚、丁基烴基甲苯(BHT)、沒食子酸丙酯(PG)和丁基烴基茴香醚(BHA)，與維生素E相近。有實驗進(jìn)一步研究了蜂膠抗氧化能力與多酚含量的量效關(guān)系，并發(fā)現(xiàn)咖啡酸衍生物、槲皮苷、兒茶酚等物質(zhì)對蜂膠抗氧化活性的關(guān)系密切。Rapta P等在證明了蜂膠醇提液中黃酮類和咖啡酸酯類具有較強的清除自由基和抗氧化能力的同時，采用測定氧化還原電勢的方法分析出高良姜素、白楊素、咖啡酸苯乙脂（CAPE）和槲皮素等活性成分具有明顯的抗氧化活性。

抗心肌細(xì)胞氧化性損傷的作用

現(xiàn)代臨床表明，蜂膠除了具有抗菌消炎、治療口腔疾病、抑制腫瘤和護(hù)肝作用外，還有使心臟肌肉抵抗阿霉素?fù)p傷、改善心血管系統(tǒng)的血液循環(huán)，預(yù)防和輔助治療高血壓、冠心病等作用。而氧自由基過量產(chǎn)生或機體內(nèi)抗氧化防御機制減弱造成的自由基堆積可引起心肌細(xì)胞氧化性損傷，是多種心血管疾病發(fā)生與演變的重要細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。因此，利用蜂膠的抗氧化性預(yù)防心血管疾病的發(fā)生及發(fā)展是許多相關(guān)領(lǐng)域研究的重點。目前，研究過程中廣泛使用的氧化損傷模型有藥物損傷、H2O2損傷、化學(xué)損傷以及電輻射等。

對藥物誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化性損傷作用

抗生素是微生物或高等動植物在生命活動中產(chǎn)生的一類次級代謝產(chǎn)物，廣泛應(yīng)用于各種惡性腫瘤治療。但長期服用會產(chǎn)生劑量依賴性心臟中毒，誘發(fā)嚴(yán)重心臟毒性，甚至導(dǎo)致心力衰竭或心臟停搏。關(guān)于抗生素引起的心臟中毒分子機制還未涉及，但其誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)機制已被多位學(xué)者證實。醫(yī)學(xué)臨床應(yīng)用較廣泛的抗腫瘤抗生素有阿霉素、柔紅霉素和鏈唑霉素等。在建立藥物損傷模型時，一方面可以利用實驗動物建立體內(nèi)氧化損傷模型，另一方面可通過原代細(xì)胞培養(yǎng)和H9C2細(xì)胞株的傳代培養(yǎng)建立體外氧化損傷模型。

體內(nèi)氧化損傷模型的建立主要采用靜脈、腹腔注射和口服的方式給藥，并根據(jù)實驗?zāi)康倪x用藥物預(yù)處理或者后處理方式。Chopra S等采用阿霉素Wiser成年大鼠損傷模型研究蜂膠醇提物對心肌氧化性損傷的作用。實驗中連續(xù)5d以50、100 mg/kg的劑量向大鼠體內(nèi)靜脈注射蜂膠醇提物，并于第5d注射10 mg/kg的阿霉素致?lián)p，30 mg/Kg的蘆丁為陽性對照。24h后收集血液和心臟組織進(jìn)行生化指標(biāo)檢測和生理病理的研究。結(jié)果經(jīng)蜂膠醇提物預(yù)處理后，受損鼠血清中的肌酸激酶（CK）、血液和組織中的谷胱甘肽（GSH）以及心臟中硫代巴比妥酸還原產(chǎn)物（TBARS）的水平明顯降低。Okutan H等以35 mg/kg的濃度向鼠體內(nèi)連續(xù)3d靜脈注射鏈唑霉素（STZ），之后連續(xù)8周每天以10 μmol/L的劑量靜脈注射CAPE，通過檢測心肌組織中MDA、SOD、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）研究CAPE抗心肌氧化損傷的作用。與空白組相比，CAPE處理組鼠的心臟組織中MDA含量顯著降低；與未經(jīng)CAPE后處理的損傷鼠相比，CAPE處理組鼠的心臟組織中SOD和CAT活性降低但GSH-Px活性顯著提高。從而得出CAPE通過其抗氧化活性可明顯改善心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷。

在體外氧化損傷模型建立方面，需要有目的性地選擇原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞或者采用細(xì)胞株進(jìn)行實驗。相關(guān)實驗結(jié)果表明，在蜂膠活性的驗證方面，兩種細(xì)胞的實驗結(jié)果是一致的。Mojzisová G 等通過體外培養(yǎng)成年鼠的心肌細(xì)胞，測定LDH漏出率和采用MTT法檢測細(xì)胞存活率比較槲皮素、松樹皮萃取物和4,5,7-三氫黃烷酮抗柔紅霉素誘導(dǎo)的心肌中毒作用，生育酚為陽性對照。各黃酮類物質(zhì)與柔紅霉素共同孵育24h后，10-4～10-6mol/L濃度范圍內(nèi)的槲皮素和4,5,7-三氫黃烷酮都可顯著提高心肌細(xì)胞的存活率，松樹皮萃取物的活性稍差。另一方面，所檢測黃酮類物質(zhì)都可抑制柔紅霉素誘導(dǎo)的LDH漏出率，且活性明顯高于生育酚。Zisová G采用H9C2細(xì)胞株比較以上幾種黃酮類物質(zhì)抗心肌細(xì)胞毒性的作用。結(jié)果與柔紅霉素共同孵育24h后，槲皮素在10-4～10-5mol/L的濃度范圍內(nèi)可明顯提高心肌細(xì)胞的存活率。而其他化合物只是在最高濃度下有保護(hù)作用；共同孵育48h后，槲皮素和4,5,7-三氫黃烷酮可在10-4～10-5mol/L明顯降低細(xì)胞的死亡率，而松樹皮萃取物和生育酚在此濃度范圍內(nèi)的心肌細(xì)胞保護(hù)作用較弱。實驗結(jié)果還表明，槲皮素和4,5,7-三氫黃烷酮可抑制心肌細(xì)胞凋亡。此實驗同樣證明了槲皮素是一種有效的抗心肌細(xì)胞氧化損傷的化合物，與原代心肌細(xì)胞的實驗結(jié)果具有可比性。因此，H9C2細(xì)胞株可作為一種有效的心肌細(xì)胞外損傷模型。

國內(nèi)學(xué)者多采用體外氧化損傷模型用于蜂膠活性的驗證，并取得一致性的結(jié)果。原代培養(yǎng)的大鼠乳鼠心肌細(xì)胞作為實驗材料，柔紅霉素和不同濃度（25、50、100 μmol/L）的槲皮素共同孵育24h后，吉姆薩染色后顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，流式細(xì)胞儀下檢測細(xì)胞凋亡率，并采用相應(yīng)的試劑盒檢測LDH、SOD和MDA等與氧化相關(guān)的指標(biāo)。結(jié)果與柔紅霉素?fù)p傷組相比，經(jīng)槲皮素處理的心肌細(xì)胞碎片減少，細(xì)胞凋亡率、LDH和MDA的含量降低，SOD活性和線粒體脫氫酶活性增高，且存在劑量效應(yīng)關(guān)系。

對H2O2誘導(dǎo)的心肌氧化損傷的作用

H2O2是超氧陰離子自由基歧化生成的一種氧化能力很強的活性氧，它與細(xì)胞內(nèi)鐵離子通過Fenton反應(yīng)生成高活性的羥自由基且通過級聯(lián)反應(yīng)生成更多自由基。外源性H2O2易于獲得、性質(zhì)相對穩(wěn)定，且極易透過細(xì)胞膜，其作用于心肌細(xì)胞后破壞心肌細(xì)胞膜、影響線粒體功能、造成細(xì)胞供能障礙，是研究蜂膠抗氧化作用的重要工具。

H2O2處理多為體外氧化損傷，可更有效地研究蜂膠抗心肌氧化損傷的作用。Sun X等用不同濃度的木犀草苷預(yù)處理H9C2細(xì)胞4h，150 μmol/L H2O2孵育6h后進(jìn)行形態(tài)學(xué)研究和生化指標(biāo)的測定，用于研究木犀草苷對H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的作用并從細(xì)胞學(xué)、形態(tài)學(xué)和分子水平上研究其抑制細(xì)胞凋亡的作用機制。結(jié)果木犀草苷可通過增強SOD、GSH-Px以及CAT的活性，明顯減少細(xì)胞凋亡率，提高抗凋亡蛋白Bcl-2、降低凋亡蛋白Bax的表達(dá)量，抑制凋亡因子的釋放量，調(diào)節(jié)H2O2誘導(dǎo)的線粒體功能紊亂。數(shù)據(jù)還表明木犀草苷可通過顯著抑制JNK和P53蛋白的表達(dá)量來抑制細(xì)胞凋亡。采用相同的H2O2損傷條件，研究異鼠李素對H9C2細(xì)胞的作用結(jié)果顯示，0～25 μmol/L的異鼠李素對心肌細(xì)胞的保護(hù)作用呈劑量依賴性，并將25 μmol/L篩選為后續(xù)細(xì)胞凋亡率以及與凋亡機制相關(guān)指標(biāo)測定時的預(yù)處理濃度。最終結(jié)果表明，異鼠李素抑制細(xì)胞凋亡的機制可能與激活Caspase-3、9，維持線粒體膜電勢，調(diào)節(jié)Bcl-2家族基因表達(dá)以及可使與細(xì)胞凋亡通路相關(guān)的ERK和P53失活有關(guān)。

Akhlaghi M等采用H9C2心肌細(xì)胞模擬心肌缺血-再灌注損傷和叔丁基H2O2損傷，比較5種黃酮類物質(zhì)對受損心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。采用顯微觀察和觀察甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）的活性直接和間接地測定細(xì)胞存活率。在缺血-再灌注損傷之前，用不同劑量的黃酮類物質(zhì)對心肌細(xì)胞預(yù)處理2-3d。結(jié)果兒茶酚具有明顯的保護(hù)作用，槲皮素在5 μmol/L下有保護(hù)作用，但濃度增加會對細(xì)胞產(chǎn)生毒性。在氧化損傷模型中，用400 μmol/L濃度的H2O2氧化損傷24h前，在25 μmol/L黃酮類物質(zhì)的長時預(yù)處理（3d）中，只有槲皮素具有顯著的保護(hù)作用，而其他物質(zhì)則表現(xiàn)出較明顯的細(xì)胞毒性；在50 μmol/L濃度下的短時預(yù)處理（1h）中，黃酮類物質(zhì)沒有表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性，且除槲皮素外，兒茶素也表現(xiàn)出明顯的保護(hù)作用。結(jié)果表明，兒茶素可有效預(yù)防缺血-再灌注損傷，槲皮素則對預(yù)防心肌心肌的氧化應(yīng)激損傷效果明顯。

選用原代培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞作為實驗材料的實驗結(jié)果同樣證明了，槲皮素可減少H2O2導(dǎo)致的心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，降低LDH漏出率和MDA產(chǎn)生量，保護(hù)SOD活性，具有抵抗細(xì)胞氧化損傷的作用。

對化學(xué)損傷誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化損傷的作用

Nabavi SF向鼠體內(nèi)連續(xù)7d靜脈注射10 和 20 mg/kg的槲皮素，之后以600ppm的劑量連續(xù)7d靜脈注射氟化鈉，測定心臟組織上清液中的SOD、CAT和還原性GSH活性等指標(biāo)，研究槲皮素對氟化鈉誘導(dǎo)的心臟氧化損傷的保護(hù)作用。結(jié)果，心臟經(jīng)槲皮素預(yù)處理后其與氧化有關(guān)的指標(biāo)明顯改善。

金毅等采用聚酰胺柱層析分離得黃酮含量為22.5%蜂膠黃酮類提取物，F(xiàn)e2+/半胱氨酸損傷原代培養(yǎng)的SD大鼠心肌細(xì)胞，研究蜂膠對氧化損傷心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，并以槲皮素為陽性對照。細(xì)胞經(jīng)25 μg/mL、50 μg/mL和100 μg/mL的蜂膠黃酮提取物和25 μg/mL的槲皮素預(yù)處理1h，加入Fe2+/半胱氨酸損傷24h后，測定細(xì)胞中MDA含量、SOD活性和LDH漏出率。2008年，隋玲娟用改良的聚酰胺柱層析方法和同樣的氧化損傷模型比較了蜂膠醇提物和槲皮素對氧化損傷性心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。結(jié)果，蜂膠醇提物的過氧化損傷和保護(hù)SOD活力的作用強于槲皮素，但對心肌細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的抑制作用則弱于槲皮素。

對其他因素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化損傷的作用

電磁輻射通過提高自由基影響生物系統(tǒng)，增強脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，改變?nèi)梭w組織抗氧化防御系統(tǒng)，從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)。因此有學(xué)者用動物模型研究CAPE對900MHZ電磁輻射誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化損傷的作用，CAPE處理組在接受輻照之前每天注射CAPE，劑量為10 μmol/mL，每天900MHZ電磁下輻照30min，連續(xù)輻照10天，電磁輻射組中，MDA和NO水平提高，SOD、CAT以及GSH-Px活力降低。CAPE處理組可明顯將結(jié)果轉(zhuǎn)變。

另有學(xué)者選用連續(xù)超負(fù)荷訓(xùn)練4周的小鼠為實驗材料，研究蜂膠黃酮對疲勞誘導(dǎo)的心肌自由基代謝和ATP酶的影響。從處死小鼠提內(nèi)取出心臟，勻漿化，離心去上清液，測定MDA、SOD、GSH-Px、CAT以及ATP酶的活性。結(jié)果蜂膠黃酮處理組小鼠SOD、GSH-Px、CAT的活性均明顯高于對照組，而MDA含量則低于對照組，并明顯抑制了由疲勞導(dǎo)致的ATP酶活性的降低。從而得出蜂膠黃酮可提高機體抗氧化能力，減少自由基對細(xì)胞的氧化性損傷。

目前，蜂膠抗心肌細(xì)胞氧化作用的研究還處于初級階段。所用的氧化損傷模型多數(shù)采為H2O2損傷和阿霉素、柔紅霉素等抗生素氧化損傷。對化合物的活性研究方面，也僅涉及了蜂膠中含量較高或者活性較明顯的化合物。而誘導(dǎo)心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的因素是多方面的，且各因素的主要氧化機制也不盡相同。蜂膠作為一種天然活性物質(zhì)，其成分極為復(fù)雜，且不同的產(chǎn)地、不同的膠源物質(zhì)以及不同的采集季節(jié)，蜂膠的化學(xué)成分存在差異，蜂膠的抗氧化作用也存在差異。因此，蜂膠的活性驗證及抗心肌細(xì)胞氧化損傷的機制研究還需要更全面、深入、系統(tǒng)化。