共聚焦激光顯微內鏡在上消化道疾病中的應用新進展

馬燕燕 虞朝輝 厲有名

●綜 述

共聚焦激光顯微內鏡在上消化道疾病中的應用新進展

馬燕燕 虞朝輝 厲有名

近年來內鏡的發展得到了很大的提升，其中共聚焦激光顯微內鏡（confocal laser endomicroscopy，CLE）是目前國際上最新的內鏡技術之一。它在傳統電子內鏡的基礎上集成了共聚焦激光顯微成像系統，可將內鏡圖像放大1 000倍左右。同時，它可對黏膜進行一定深度的斷層掃描成像，觀察腺體、細胞核微血管的顯微結構，有助于內鏡下作出組織學診斷并指導靶向活檢。

1 CLE的原理

CLE是將傳統電子內鏡的頭端整合上一個小型的共聚焦激光顯微鏡，激光源發出的波長為488nm的激光束，激發被檢組織中的熒光物質，發出不同方向的熒光，經光源針孔及透鏡聚焦于被觀察平面某一點，該點反射光經同一透鏡聚焦于觀察針孔形成點像，并通過針孔被探測器接收。由于物鏡和會聚透鏡的焦點在同一光軸上，因而稱這種成像方式為共聚焦成像。當激光逐點掃描檢測組織，針孔后的光電倍增管也逐點獲得對應光點的共聚焦圖像，并將之轉化為數字信號傳輸至計算機，最終在屏幕上聚合成清晰的整個焦平面的共聚焦圖像。將焦平面依次位于檢測組織的不同層面上，便可以逐層獲得組織相應的光學橫斷面的圖像，稱為“光學切片”。在內鏡檢查的同時獲得黏膜不同層面的“光學切片”，因此被譽為“光學活檢”。

2 CLE在上消化道疾病診斷中的應用

Martinez等[1]用24h食管pH檢測發現非糜爛性反流病（non-erosive reflux disease，NERD）的異常率只有50%左右，診斷NERD的敏感性0%～71%，特異性85%～100%，因此NERD患者常規行24h食管pH監測并非必要。隨著內鏡技術的發展，有研究發現NERD患者雖然不存在食管黏膜的破損，但是存在一些微小病變，例如齒狀線上血管網或血管斑、黏膜表面絨毛感、黏膜島的形成及微糜爛[2]，這些發現均有助于NERD的診斷。同時，CLE還能更清晰地觀察到食管黏膜上皮乳頭內毛細血管袢形態、管徑的變化和細胞間隙增寬，而這些變化在諸多的研究中都被證實了其在NERD臨床表現及診斷中的意義[3]，因此CLE為NERD的診斷提供了新的有價值的檢查方法。

Barrett食管（BE）是指食管下段黏膜的復層鱗狀上皮被單層柱狀上皮所替代的一種病理現象，屬于一種癌前病變。典型的Barrett食管化生柱狀上皮形態呈絨毛狀，與賁門或胃柱狀上皮不同，其特征性的杯狀細胞也很容易識別。目前BE的診斷基于內鏡與病理組織檢查的統一，但內鏡診斷率較高而組織病理診斷率較低的脫節現象普遍存在。Kiesslich等[4]首先報道了將CLE用于BE診斷，其敏感性和特異性分別為99.9%和94.4%，他在進一步研究中又報道了CLE在診斷BE上皮化生的準確性為96.8%，BE瘤變的準確性為97.4%[5]。隨后，Becker、Liu和Dunbar等[6-8]也通過調查研究得出相似的文獻報道，其中Dunbar等[8]采用雙盲、隨機交叉試驗研究了46例BE患者，其中18例疑似伴有上皮內瘤變患者，與普通內鏡下的四象限活檢相比，CLE下的靶向活檢對上皮內瘤變的檢出率明顯提高（33.7%比17.2%）。2011年Sharma的一項國際多中心合作研究表明相對于白光內鏡和色素內鏡，CLE靈敏度大幅度提高，而用基于探針的CLE（probe-based CLE，pCLE）結合白光和色素內鏡，對BE患者檢測時靈敏度可達100%，陰性預測值可達100%，對可疑部位進行活檢可以避免76%的活檢。Johnson等[9]報道了4例pCLE為BE患者的診治研究，發現pCLE不僅能降低活檢數量，提高活檢陽性率，而且CLE能確定對治療效果進行現場評估，確定后續治療方案。隨著研究的進展，CLE在Barrett食管的診斷中作用會顯得越來越重要。

20世紀90年代之后，色素內鏡的應用使得早期鱗癌的檢出率大大提高，有研究顯示盧戈液噴灑可檢出100%高級別上皮內瘤變，而普通內鏡僅有55%[10]。然而單純應用碘染篩檢食管瘤變組織，將會增加許多不必要的活檢，而且盧戈液的碘劑過敏、食管痙攣等不良反應限制了其臨床應用。內鏡技術的革新使得激光共聚焦顯微內鏡能觀察到消化道黏膜的單個上皮細胞和微血管形態。Deinert等[11]最早描述了1例早期食管鱗癌在CLE下的圖像特點，后來其病理證實為高分化鱗癌。Pech等[12]也單獨應用熒光素鈉顯影，通過觀察共聚焦下鱗狀上皮細胞和乳頭內毛細血管袢形態的改變診斷早期食管癌。由此可得知，不規則排列的鱗狀上皮細胞、增粗或扭曲血管團狀或長分支狀的乳頭內毛細血管袢是食管淺表鱗癌共聚焦圖像的顯著特征，其敏感性和特異性高達92.8%和100%。再者，腫瘤細胞的一個重要病理特征就是細胞核體積增大，核質比增大。因此使用吖啶黃熒光對比劑后，CLE可發現食管高級別上皮內瘤變和早期鱗癌在淺層的明顯增大的細胞核，能進一步對其進行診斷。

2005年，Kiesslich等[13]首次報道了CLE在Hp診斷中的應用，他發現胃內有吖啶黃著色的聚集或單個菌體，用共聚焦圖像放大后甚至可見單個細菌的菌體和鞭毛，觀察部位取活檢行銀染、免疫組化、尿素試驗及活檢組織培養均證實為Hp感染。隨后Hoffman等[14]也嘗試了用CLE，利用吖啶黃染色來診斷Hp感染。

我國胃癌病死率居世界首位，胃癌及癌前病變的內鏡診斷率總體不高。眾所周知，胃癌前病變的病理組織學特征是胃黏膜的不典型增生及含有杯狀細胞的腸化生上皮，而早期胃癌的病理學特點是細胞結構異常、染色質凝聚和核漿比例增大，兩者共聚焦圖片完全不同，很容易鑒別診斷。Kitabatake等[15]利用CLE對27例早期胃癌患者進行了觀察發現腺體和黏膜微血管排列不規則，將共聚焦圖像與病理組織學圖像進行對方后，提示共聚焦圖像完全可以進行實體組織性診斷。之后，Kakeji等[16]也通過對研究證實可以依據共聚焦圖像來診斷早期胃癌。共聚焦內鏡還觀察到胃黏膜微血管的改變，正常胃黏膜的微血管結構呈蜂窩狀或螺管形，規則分布于胃小凹周圍，分化型胃癌血管明顯增多、形狀和管徑各不相同，而未分化型胃癌則微血管明顯減少，呈不連續的短枝狀[17]。因此，將微血管結構和胃小凹的結構結合加以分析將更有助于對早期胃癌的診斷。

正常十二指腸黏膜無小凹表現，表面覆蓋典型的柱狀上皮細胞，可見大量杯狀細胞，深部微血管網密集。1995年，Holmqren等[18]應用共聚焦內鏡發現乳糜瀉患者的十二指腸黏膜細胞骨架是紊亂的。乳糜瀉患者的共聚焦顯微內鏡能夠顯示絨毛萎縮和上皮內淋巴細胞數目增多，方便快速地在體診斷乳糜瀉。Leong等[19]對乳糜瀉患者的十二指腸黏膜作CLE與組織病理學檢查，比較結果顯示CLE診斷乳糜瀉具有很高的優越性：敏感性94%、特異性92%。

CLE作為一項新型診斷工具，雖然應用于臨床的時間不長，但是其臨床價值卻日益重要。共聚焦內鏡的出現標志著內鏡檢查從表層走向深層、從宏觀到微觀、從形態學邁向組織學的質變。不僅如此，熒光對比劑的應用可在顯微內鏡下進行特異性染色，不僅更易發現早期腫瘤及癌前病變，而且對腫瘤靶向治療也是CLE進一步研究的方向。因此，CLE所具有的獨特優勢必將對上消化系統疾病的診斷產生劃時代的意義。

[1] Martinez S D,Malagon I B,Garewal H S,et al．Non-erosive reflux disease(NERD)-acid reflux and symptom patterns[J]．Aliment Pharmacol Ther,2003,17(4):537-545．

[2] Kiesslich R,Kanzler S,Vieth M,et al．Minimal change esophagitis:prospective comparison of endoscopic and histological markers between patients with non-erosive reflux disease and normal controls using magnifying endoscopy[J]．Dig Dis,2004,22: 221-227．

[3] Orlando L A,Orlando R C．Dilated intercellular spaces as a marker of GERD[J]．Curr Gastroenterol Rep,2009,11(3):190-194．

[4] Kiesslich R,Burg J,Vieth M,et al．Confocal laser endoscopy for diagnosing intraepithelial neoplasias and colorectal cancer in vivo[J]．Gastroenterology,2004,127(3):706-713．

[5] Kiesslich R,Gossner L,Goetz M,et al．In vivo histology of Barrett's esophagus and associated neoplasia by confocal laser endomicroscopy[J]．Clinical Gastroenterology and Hepatology,2006, 4(8):979-987．

[6] Becker V,Vieth M,Bajbouj M,et al．Confocal laser scanning fluorescence microscopy for in vivo determination of microvessel density in Barrett's esophagus[J]．Endoscopy,2008,40:888-891．

[7] Liu H,Li YQ,Yu T,et al．Confocal laser endomicroscopy for superficial esophageal squamous cell carcinoma[J]．Endoscopy, 2009,41:99-106．

[8]Dunbar K B,Okolo P,Montgomery E,et al．Confocal laser endomicroscopy in Barrett's esophagus and endoacopically inapparent Barrett's neoplasia:a prospective,randomized,double-blind, controlled,crossover trial[J]．Gastrointest Endosc,2009,70:645-654．

[9] Johnson E A,De Lee R,Aqni R,et al．Probe-Based Confocal Laser Endomicroscopy to Guide Real-Time Endoscopic Therapy in Barrett's Esophagus with Dysplasia[J]．Case Rep Gastroenterol,2012,6(2):285-292．

[10] Hashimoto C L,Iriya K,Baba E R,et al．Lugol's dye spray chromoendoscopy establishes early diagnosis of esophageal cancer in patients with primary head and neck cancer[J]．Am J Gastroenterol,2005,100(2):275-282．

[11] Deinert K,Kiesslich R,Vieth M,et al．In-vivo microvascular imaging of early squamous-cell cancer of the esophagus by confocal laser endomicroscopy[J]．Endoscopy,2007,39:366-368．

[12]Pech O,Rabenstein T,Manner H,et al．Confocal laser endomicroscopy for in vivo diagnosis of early squamous cell carcinoma in the esophagus[J]．Clin Gastroenterol Hepatol,2008,6:89-94．

[13] Kiesslich R,Goetz M,Burg J,et al．Helicobacter pylori in vivo by confocal laser endoscopy[J]．Gastroenterology,2005,128: 2119-2123．

[14] Hoffman A,Goetz M,Vieth M,et al．Confocal laser endomicroscopy:technical status and current indications[J]．Endoscopy,2006,38:1275-1283．

[15] Kilabatake S,Niwa Y,M iyahara R,et al．Confocal endomicroscopy for the diagnosis of gastric cancer in vivo[J]．Endoscopy,2006,38(11):1110-1114．

[16]Kakeji Y,Yamaguchi S,Yoslfida D,et al．Development and assessment of morphologic criteria for diagnosing gastric cancer using confocal endomiroscopy:an ex vivo and in vivo study[J]．Endoscopy,2006,38(9):886-890．

[17] Liu H,Li Y Q,Yu T,et al．Confocal endomicroscopy for in vivo detection of microvascular architecture in normal and malignant lesions of upper gastrointestinal tract[J]．J Gastroenterol Hepatol,2008,23(1):56-61．

[18]Holmqren P K,Maqnusson K E,Stenhammar L,et al．Confoeal laser scanning microscopy of small-intestinal mucosa in celiac disease[J]．Scand J Gastroenterol,1995,30(3):228-234．

[19] Leong R W,Nquyen N Q,Meredith C G．et al．In vivo confocal endomicroseopy in the diagnosis and evaluation of celiac disease[J]．Gastroenterology,2008,135(6):1870-1876．

2013-03-21）

（本文編輯：沈昱平）

310003 杭州，浙江大學醫學院附屬第一醫院消化內科

厲有名，E-mail：zlym@zju.edu.cn