腹腔鏡胃癌根治術患者外周血CK19mRNA的變化及意義

倪開元 徐鯤杰 洪曉明 汪東杰

腹腔鏡胃癌根治術患者外周血CK19mRNA的變化及意義

倪開元 徐鯤杰 洪曉明 汪東杰

目的 探討腹腔鏡胃癌根治術患者外周血CK19mRNA的變化及意義。 方法 采用熒光定量聚合酶鏈反應（FQ-PCR）技術檢測CK19mRNA在腹腔鏡組（14例）及開腹組（37例）胃癌根治術外周血的表達情況。結果 兩組間僅手術時間差異有統計學意義（P＜0.01），術中失血量及清除淋巴結數的差異均無統計學意義（均P＞0.05）。腹腔鏡組患者手術前后CK19mRNA的表達無明顯變化（P＞0.05）。開腹組患者手術前后CK19mRNA的表達差異有統計學意義（P＜0.05）。開腹組術后CK19mRNA陽性表達患者明顯多于腹腔鏡組，差異有統計學意義（P＜0.05）。 結論 與開腹手術相比，腹腔鏡胃癌根治術可以降低靜脈血CK19mRNA的陽性率，減少術后腫瘤血循微轉移的危險性。

腹腔鏡 胃癌 微轉移 細胞角蛋白19 mRNA

目前，盡管腹腔鏡胃癌根治術技術日趨成熟，在胃癌高發的亞洲地區應用越來越廣泛，但其對患者術后血循環微轉移的影響仍不完全確定，尚存在爭議。本研究采用FQ-PCR技術檢測腹腔鏡胃癌根治術患者手術前后外周血細胞角蛋白19（CK19）的表達情況，旨在探討腹腔鏡胃癌根治術對腫瘤細胞血循環微轉移的影響。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2009-06—2011-03收治的胃癌患者51例，術前均常規行電子胃鏡活檢或超聲胃鏡檢查，明確病變部位及病理類型，病理檢查確診為胃癌。術前常規行胸片、心電圖、腹部超聲及全腹部CT平掃+增強檢查，無肝臟及其他部位轉移征象。排除TNM分期Ⅳ患者。其中采用腹腔鏡胃癌根治術治療14例（腹腔鏡組），男11例，女3例；年齡37～68（58±11）歲；TNM分期：Ⅰ期2例，Ⅱ期5例，Ⅲ期7例；腫瘤部位：胃上1/3者3例，胃中1/3者1例，胃下1/3者10例。采用開腹手術治療37例（開腹組），男31例，女6例；年齡49～77（63±12）歲；TNM分期：Ⅰ期2例，Ⅱ期11例，Ⅲ期19例；腫瘤部位：胃上1/3者3例，胃中1/3者1例，胃下1/3者10例。兩組患者性別、年齡、TNM分期及腫瘤部位的差異均無統計學意義（均P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 手術方法 兩組患者均遵循無瘤原則進行手術，嚴格按照腫瘤根治原則進行手術操作，淋巴廓清均為D2程度。兩組手術均由同一組醫師實施。

1.2.2 標本處理 兩組患者均于手術當天術前行頸內靜脈深靜脈置管，在全麻達成后不同時段[手術開始前、氣腹撤除后（腔鏡組）、關腹后（開腹組）]進行采血。棄去注射器抽取的前5ml血液，以減少標本污染，再抽取5ml血液加入消毒肝素抗凝冷凍管，術后標本2 000r/min離心10min，立即放入-80℃低溫冰箱凍存，而后統一檢測（標本采集后2d內完成）。

1.2.3 FQ-PCR檢測

1.2.3.1 外周血單核細胞的提取 取出血液標本，于電熱恒溫水槽快速解凍。將5ml抗凝外周血加入等體積0.9%氯化鈉注射液稀釋，取10ml離心管，先加入2ml淋巴細胞分離液，再取稀釋好的標本5ml沿管壁緩慢加入，4℃靜置5min后，2 000 r/min離心10min，吸取白細胞層（勿吸取底部紅細胞層）于1.5ml離心管中，12 000r/ min離心5min，棄上清液，沉淀加入1ml0.9%氯化鈉注射液輕輕吹打均勻，12 000r/min離心5min，棄上清液，留取沉淀備用。

1.2.3.2 細胞總RNA提取 沉淀加入1ml RNA提取液（Trizol），充分混勻。室溫靜置5min，加入0.2ml氯仿，封蓋后用力振搖 15s，4℃靜置 5min，而后 4℃下 12 000r/min離心10min，離心后反應管分3層，底層為氯仿層，中間層及無色水相上層，水相上層的體積一般為提取液體積的60%。將上層水相轉移至滅菌的離心管中，加等體積異丙醇輕輕混勻4℃靜置10min，然后4℃下12 000r/min離心15min（離心前通常未見RNA沉淀，離心后可見膠狀沉淀）。棄上清液，加入1ml75%的乙醇(注：75%乙醇配制時須用DEPC H2O）洗滌RNA沉淀，4℃下7 500 r/min離心5min，小心吸去大部分乙醇。將沉淀在室溫空氣中干燥10min。用40μl DEPC H2O溶解沉淀，-80℃保存備用。

1.2.3.3 逆轉錄反應 取滅菌0.2ml離心管配備逆轉錄體系，Oligo（dT）18Primer 1μl、DEPC-treatedWater 6μl、提取的RNA 5μl，70℃下5min后立刻置于冰上1min。緊接上一步，5×Reaction Buffer 4μl、RiboLock RNase Inhibitor 1μl、10mmol/LdNTP mix 2μl，37℃下5min后立刻置于冰上1min。立即取RevertAidTMM-MuLVRT 1μl，于42℃下60min、70℃下10min后-80℃保存。

1.2.3.4 試劑配制 從試劑盒中取出CK19反應液，在室溫下融化并振蕩混勻后，2 000r/min離心10s。計算需準備反應數n[n=樣本數+1（陰性對照）+1（陽性對照）+4（定量標準品）]。測試反應體系配制方法：CK19反應液44μl，Taq酶1μl。計算上述各試劑的使用量，加入離心管中，充分混勻后，按45μl量分別分裝到不同的PCR反應管中，反應管中分別加入5μl的陰性對照、陽性對照、逆轉錄好的cDNA及定量標準品（標準品需倍比稀釋成107、106、105、104），瞬時離心準備上機。

1.2.3.5 實時定量PCR擴增及結果分析 將各反應管按一定順序放入PCR儀上，按以下程序進行PCR擴增：預變性93℃30min，然后93℃45s、55℃60s共40個循環。選擇在第二步第二階段采集FAM熒光信號進行檢測。反應結束后保存檢測數據文件。調節baseline cycle至2～15，閾值設定原則以閾值線剛好超過正常陰性對照品的最高點，最后到Reporter窗口下記錄儀器自動分析計算出的值。檢測樣本Ct≤37.0者判為陽性，Ct＞37.0者重測，重測結果Ct值＜40者為陽性，否則為陰性。

1.3 統計學處理 采用SPSS16.0統計軟件，計量資料均以表示，組間比較采用t檢驗，率的比較用χ2檢驗或Fisher確切概率法。

2 結果

2.1 兩組患者手術情況的比較 腹腔鏡組手術時間255～345（280±73）min，術中失血量60～200（100± 30）ml，清除淋巴結11～24（12±3.5）枚；開腹組手術時間150～255（160±58）min，術中失血量100～400（110±40）ml，清除淋巴結11～29（13±2.5）枚。兩組間僅手術時間差異有統計學意義（P＜0.01），術中失血量及清除淋巴結數的差異均無統計學意義（均P＞0.05）。2.2 兩組患者手術前后外周血CK19mRNA的表達情況 腹腔鏡組患者術前外周血CK19mRNA陽性5例（35.71%），陰性9例；術后陽性6例（42.86%），陰性8例（57.14%）；手術前后CK19mRNA的表達無明顯變化（P＞0.05）。開腹組患者術前外周血CK19mRNA陽性13例（35.14%），陰性24例；術后陽性25例（67.6%），陰性12例（32.4%）；手術前后CK19mRNA的表達差異有統計學意義（P＜0.05）。開腹組術后CK19mRNA陽性表達患者明顯多于腹腔鏡組，差異有統計學意義（P＜0.05）。

3 討論

微轉移通常是指非血液系統的惡性腫瘤在發展過程中，擴散并存活于血循環、骨髓、淋巴系統、肝及肺等組織器官中的微小腫瘤細胞灶，能夠逃避免疫監視、侵犯血管和發展成為肉眼可見的病變。一般情況下，常規檢查方法如B超、增強CT掃描、核磁共振成像、單克隆抗體放射免疫顯影技術、普通病理檢查都很難發現。目前認為，臨床轉移是由微轉移發展而來，但腫瘤細胞進入淋巴管和血管后并不意味著一定都會發生轉移，最終僅有少數微轉移能發展為臨床轉移。

CK19是Ⅰ型細胞骨架中中間纖維的一種，具有嚴格的組織特異性。其局限表達于胃腸上皮細胞，在所有的胃癌組織中幾乎都明顯表達，且在侵襲、轉移、擴散到其他組織器官時始終保持穩定[1-2]。Fujita等[3]的研究顯示，較之CK18、CK20和CEA，CK19是檢測胃癌血循環微轉移的更好的標志物。檢測胃癌患者外周血液微轉移CK19可提高胃癌臨床分期的準確性，幫助綜合判斷患者的預后，且可能有助于早期診斷胃癌遠處臟器微小轉移，指導術后輔助治療的選擇[4]。

目前，盡管FQ-PCR方法具有較高的敏感性，對腫瘤細胞的檢出率較高，但采用FQ-PCR方法或其他方法檢測出的血循環中的腫瘤細胞或微轉移灶對判斷癌癥患者的預后有無影響尚無定論，因為癌細胞在血液循環中的播散并不等于一定會出現轉移癌，無臨床轉移癌也不等于無癌細胞播散。胃癌細胞或微轉移灶若存在于血液循環中，仍舊增加了胃癌復發及遠處轉移的危險性，其也是形成臨床遠處轉移的先決條件，因此可以通過監測外周血中的CK19mRNA來觀察胃癌患者血循環微轉移的變化。

有研究表明，CK19mRNA在胃癌外周血中的陽性表達率為38.4%～77.35%[5-7]。而本研究結果顯示，胃癌患者術前外周血中CK19mRNA的陽性表達率為31.37%，低于文獻報道，這可能與檢測方法、檢測試劑以及入選病例不同有關。腹腔鏡組患者手術前后外周血CK19mRNA陽性表達率無明顯變化，而開腹組術后外周血CK19mRNA的陽性表達率明顯上升，提示腹腔鏡手術并未顯著增加血液CK19mRNA陽性表達率，較之開腹手術可以降低靜脈血CK19mRNA的陽性表達率，減少術后腫瘤血循微轉移的危險性。筆者認為，腹腔鏡手術在操作中通過影像系統使術野有一定的放大效應，可以使解剖更精細，術中用抓鉗對少量組織抓持進行暴露，游離過程中對腫瘤的機械性刺激小，超聲刀的使用在切斷管道的同時使其斷端閉合，減少了癌細胞播散的機會，有助于減少腫瘤細胞的擴散。現階段，腹腔鏡胃癌根治術仍處于探索階段，本研究初步證實腹腔鏡手術能夠減少腫瘤細胞在血循環中的微轉移，但臨床遠期療效及其對術后腫瘤復發、轉移的影響還有待長期隨訪和多中心臨床試驗及循證醫學證實。

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Expression of CK19 mRNA in patients with gastric cancer undergoing laparoscopic radical resection and its clinical significance

Gastric cancerMicrometastasis Laparoscopy CK19 mRNA

2012-08-14）

（本文編輯：歐陽卿）

315100 寧波市鄞州第二醫院普外科

【 Abstract】Objective To investigate the expression of CK19 mRNA in patients with gastric cancer undergoing laparoscopic radical resection and its significance. Methods The expression of peripheral blood CK19mRNA was detected by fluorescence quantitative polymerase chain reaction(FQ-PCR)technology in patients with gastric cancer undergoing laparoscopic radical resection(laparoscopy group,n=14)or laparotomy resection(laparotomy group,n=37).Results The operation time in laparoscopy group was shorter than that in laparotomy group(P＜0.01),while there were no significant differences in e intraoperative blood loss and number of removed lymph node between two groups(P＞0.05).There was no difference in expression of CK19mRNA before and after operation in laparoscopy group(P＞0.05),while there was statistically significant in laparotomy group (P＜0.05).The rate of positive CK19mRNA expression in laparotomy group after operation was higher than that in laparoscopic group(P＜0.05). Conclusion Compared to laparotomy,laparoscopic radical resection of gastric cancer can reduce the positive rate of CK19mRNA expression in peripheral blood and the risk of tumor micrometastasis after operation.