石菖蒲水煎劑對癲癇大鼠腦部神經發生及認知功能的影響

李海峰 王 慧 夏哲智 浙江大學醫學院附屬兒童醫院 杭州 310003

趙彥婷 河北省平山縣人民醫院

石菖蒲水煎劑對癲癇大鼠腦部神經發生及認知功能的影響

李海峰 王 慧 夏哲智 浙江大學醫學院附屬兒童醫院 杭州 310003

趙彥婷 河北省平山縣人民醫院

目的：探討石菖蒲水煎劑對癲癇大鼠腦部神經發生的影響和對癲癇認知障礙的治療作用。方法：SD大鼠30只，隨機分為正常對照組、癲癇模型組和石菖蒲灌胃組，每組10只。癲癇模型組和石菖蒲灌胃組采用印防己堿（PTX）建立癲癇動物模型，采用5-溴脫氧尿苷嘧啶（5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU）腹腔注射標記內源性神經干細胞（NSC）。正常對照組、癲癇模型組予生理鹽水灌胃，石菖蒲灌胃組予石菖蒲水煎劑10mg/（kg·d）灌胃，共30天。治療前后進行鼠癲癇發作Racine評級、皮層腦電圖檢測、腦內BrdU陽性細胞免疫組化檢測和Morris水迷宮檢測。結果：Morris水迷宮檢測顯示，癲癇模型組逃避潛伏時間長于石菖蒲灌胃組和正常對照組（P＜0.05）；癲癇模型組目標象限內的游泳時間占整個游泳時間的百分率明顯低于石菖蒲灌胃組和正常對照組（P＜0.05）。石菖蒲灌胃組大鼠Ⅲ～Ⅴ級癲癇發作頻率、皮層腦電圖頻率、波幅降低、Brdu陽性細胞數升高，與癲癇模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。結論：大鼠發生癲癇后，啟動自我保護機制，石菖蒲干預后明顯增強了保護機制。

大鼠 癲癇 石菖蒲水煎劑 認知功能

癲癇是一組反復發作的神經元異常放電所致的暫時性中樞神經系統功能失常的慢性疾病，是神經系統僅次于腦血管疾病的第二大病種，嚴重影響患者生活質量。國內流行病學調查表明，我國癲癇的發病率約23/10萬，現有約455～630萬癲癇患者[1]。雖然新的抗癲癇藥物不斷出現，但國內外眾多回顧性研究顯示癲癇的1年緩解率為70%～80%，約20%～30%癲癇患者發作得不到緩解，成為慢性難治性癲癇（intractable epilepsy）。長期反復發作及藥物副作用嚴重威脅著癲癇患者的日常生活[2]。中藥因其副作用小，用于對抗癲癇備受關注[3]。石菖蒲為天南星科（Araceae）多年生草本植物石菖蒲Acori Tatarinowii Rhizoma的干燥根莖，具有化痰開竅、化濕和胃、醒神益智、理氣活血、散風祛濕等功效[4]。臨床和實驗觀察發現石菖蒲在中樞神經系統方面主要有抗驚厥、鎮靜催眠、促進學習記憶等作用[5-6]。本研究應用石菖蒲水煎劑治療印防己堿（PTX）癲癇動物模型大鼠，觀察石菖蒲水煎劑對大鼠腦部神經發生的影響以及對癲癇認知障礙的治療作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑 6周齡清潔級SD大鼠，體質量（150±20）g，浙江省醫學科學院動物中心提供，實驗動物合格證：SCXK（浙）2008-0033；印防己堿（PTX）（Sigma公司，美國）；5-溴脫氧尿苷嘧啶（5-bromo-2 -deoxyuridine，BrdU）（Sigma公司，美國）；鼠抗Brdu單克隆抗體（Sigma公司，美國）；兔抗GFAP（星型膠質細胞酸性蛋白）多克隆抗體（Zymed公司，美國）；鼠抗TUJ-1（神經元tao蛋白）單克隆抗體（Promega公司，美國）；羊抗Nestin（神經巢素蛋白）多克隆抗體（Promega公司，美國）；DAPI（Roche公司，美國）；羊抗鼠Cy3熒光二抗，羊抗兔Cy3熒光二抗（Sigma公司，武漢博士德分裝）；鼠抗羊FITC熒光二抗，羊抗鼠FITC熒光二抗（中山金橋公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組 SD大鼠30只，隨機分為正常對照組、癲癇模型組和石菖蒲灌胃組，每組10只。

1.2.2 印防己堿（PTX）慢性癲癇模型制備 PTX用生理鹽水配成1mg/mL溶液，注射前24h新鮮配制，大鼠每天晨8～11時腹腔注射PTX 1.5mg/（kg·d），共20天，正常對照組腹腔注射同等劑量生理鹽水。每次注射后根據Racine標準觀察大鼠行為（1小時），判定是否出現癲癇樣發作。Racine標準：0級：無驚厥；I級：面部陣攣；Ⅱ級：I級+節律性點頭；Ⅲ級：Ⅱ級+前肢陣攣；Ⅳ級：Ⅲ級+后肢站立；Ⅴ級：Ⅳ級+跌倒。將連續3次Ⅳ～Ⅴ級發作認為動物被完全點燃，即癲癇模型造模成功，繼續腹腔注射PTX 1.5mg/（kg·d）以維持點燃效果，將5次以上Ⅲ級及Ⅲ級以上發作納入實驗組，死亡及其他則剔除實驗。

1.2.3 內源性神經干細胞標記 造模成功后，癲癇模型組、石菖蒲灌胃組大鼠予BrdU注射，劑量50mg/（kg·d），連續注射7天以標記內源性神經干細胞。

1.2.4 石菖蒲水煎劑干預 造模成功后，石菖蒲灌胃組予新鮮制備的33%石菖蒲水煎劑灌胃，劑量10mg/（kg·d）；正常對照組、癲癇模型組予等量生理鹽水灌胃。干預時間共30天。

1.3 檢測指標 觀察各組干預前后癲癇發作頻率及以下指標。

1.3.1 Morris水迷宮學習記憶功能 ①定位航行實驗：實驗前1天將大鼠置于水迷宮中自由游泳30min，以適應水迷宮環境。在學習過程中，大鼠連續訓練5天，每天分2個時段，每個時段訓練2次，間隔為60min。每次實驗大鼠在4個不同象限中將頭朝池壁放入水池，每天次序不同，任其游泳，直至找到平臺（平臺象限設置在Ⅰ象限）。記錄120s內尋找到水下平臺的時間（逃避潛伏期），并允許大鼠在平臺上停留10s以達到強化記憶效果；如果大鼠在120s內未到達平臺，逃避潛伏期以120s記錄，并由實驗者用桿子將其引至平臺停留30s，此項反應大鼠的學習能力。②空間探索實驗：實驗第6天進行，撤除平臺，任意選1個入水點將大鼠放入水中，記錄其在60s內的游泳軌跡，分別計算其跨越目標象限內的游泳時間占整個游泳時間的百分率、跨越平臺次數，此項反應大鼠的空間記憶能力。

1.3.2 大鼠腦皮層腦電圖 大鼠1%戊巴比妥（30mg/ kg腹腔注射）麻醉后，固定在定位儀上，剪去頭頂部頭皮，暴露顱骨，按大鼠腦圖譜，選定雙側海馬坐標（前后3.6mm，中線旁開4.9mm，顱骨表面下0.5mm），在顱骨相應位置上鉆一直徑0.8mm小孔，分別埋入一單芯電極，以牙托粉固定，作為記錄皮層腦電圖的引導電極。術后連續3天，予頭部皮膚清潔消毒，并腹腔注射卡那霉素0.5mL預防感染；待大鼠基本恢復正常后，利用多向生理記錄儀對腦電圖進行記錄，參數設置：靈敏度500μV，濾波100Hz，掃描速度200ms/div，以出現尖波、棘波、尖（棘）慢波為癇性發作。致癇后連續記錄10min，然后每間隔5min記錄lmin，記錄1小時；并同時觀察大鼠行為，予石菖蒲干預后再次記錄腦電圖。

根據調查，海外游客主要是通過旅行社的推薦介紹了解蜀岡-瘦西湖風景名勝區的情況，可見景區自身在海外的宣傳促銷力度不夠.應針對海外旅游者的特點，充分利用國內外各種宣傳媒體、海外旅行社、網絡及報刊雜志等媒介，創新旅游宣傳促銷方式，加大旅游宣傳促銷的力度；制定海外重點客源市場促銷計劃，根據細分后的海外客源目標市場，有重點、分層次地進行旅游宣傳；認真辦好一年一度的“煙花三月國際經貿旅游節”，不斷創新經貿旅游節的內容和方式，吸引更多的海外宣傳媒體和貿易商參會，以招徠更多的海外旅游者.

1.3.3 免疫組化檢測腦內神經干細胞增殖、遷移及其分化情況 組織切片的制備：大鼠接受皮層腦電圖后立即進行心臟灌注固定，固定后用4%多聚甲醛浸泡繼續固定24h，分別經過15%及30%蔗糖4℃梯度脫水24h。從視交叉后2mm至側腦室后角行連續冠狀冰凍切片，片厚30μm，切片保存于4℃0.01M PBS緩沖液中，1周內完成免疫化學檢測。免疫組織熒光三標（DAPI/BrdU/Nestin、DAPI/BrdU/GFAP、DAPI/ BrdU/TUJ-1）檢測：切片入0.2%Triton X-100溶液中，37℃孵育30min，之后入2mol/L HCl中37℃作用30min，再入正常山羊血清封閉液，37℃孵育30min，切片入Brdu一抗液（鼠抗BrdU單克隆抗體）中，濕盒內4℃冰箱孵育48h。切片入熒光二抗，濕盒內37℃孵育30min。之后進行第二種神經性一抗（羊抗Nestin多克隆抗體，兔抗GFAP多克隆抗體，小鼠抗TUJ-1單克隆抗體）4℃孵育24h，熒光二抗濕盒內37℃孵育30min，最后貼片，50%緩沖甘油封片，激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察。

1.4 統計學方法 應用SPSS13.0軟件進行統計學分析，實驗數據以均數±標準差（±s） 表示，采用方差分析，用Bonferroni法進行兩兩比較，對于方差不齊同的組間比較用Welch法進行分析，以P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 石菖蒲干預前后癲癇發作頻率比較 造模后癲癇模型組、石菖蒲灌胃組大鼠癲癇Ⅳ～Ⅴ級發作次數分別為（2.3±0.6）次和（2.5±0.5）次，組間差異無統計學意義（P＞0.05）；Ⅲ級發作次數分別為（8.8±1.6）次和（8.5±1.8）次，組間差異無統計學意義（P＞0.05）；分別接受生理鹽水灌胃及石菖蒲灌胃后Ⅳ～Ⅴ發作次數分別為（2.5±0.9）次和0次，組間差異有統計學意義（P＜0.05）；Ⅲ級發作次數分別為（8.7±2.1）次和（2.3±0.8）次，兩組間差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 干預前后皮層腦電圖頻率及波幅比較 造模前，各組皮層腦電圖基礎頻率、基礎波幅均為正常范圍，各組間差異無統計學意義（P＞0.05）；造模后，癲癇模型組、石菖蒲灌胃組大鼠皮層腦電圖基礎頻率、基礎波幅均明顯升高（P＜0.05），兩組間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；治療后，癲癇模型組、石菖蒲灌胃組大鼠皮層腦電圖頻率、波幅比較，差異有統計學意義，石菖蒲灌胃組明顯少于癲癇模型組（P＜0.05），見表1。

表1 各組皮層腦電圖頻率及波幅比較（x±s）

注：與造模前比較，*P＜0.05；與癲癇模型組比較，△P＜0.05

組別正常對照組癲癇模型組石菖蒲灌胃組頻率/Hz 6.7±1.2 6.2±1.6 7.1±1.2波幅/μV 38.7±4.2 40.2±3.8 37.5±4.1 n/只10 10 10頻率/Hz 5.9±1.1* 19.3±4.2* 19.8±4.9*波幅/μV 37.6±3.4* 468.6±23.6* 479.3±21.9*頻率/Hz 6.1±1.3 20.5±4.7* 10.4±3.2△波幅/μV 39.1±4.0 475.6±27.1* 132.5±14.3*△造模前 造模后 治療后

2.3 石菖蒲干預后神經行為改變

2.3.1 Morris航行定位實驗 正常對照組、癲癇模型組和石菖蒲灌胃組的逃避潛伏時間分別為（14.16± 2.90）s、（62.63±6.660）s、（30.60±5.30）s，癲癇模型組逃避潛伏時間明顯高于石菖蒲灌胃組和正常對照組（P＜0.05）。

2.3.2 Morris空間探索實驗 正常對照組、癲癇模型組和石菖蒲灌胃組的平臺象限泳距占總泳距的比例分別為0.62±0.04、0.31±0.03、0.48±0.03，三組間差異均有統計學意義（P＜0.05）。

陽性細胞增殖：BrdU陽性免疫組織化學顯示，正常對照組、癲癇模型組和石菖蒲灌胃組BrdU陽性細胞數分別為（203.50±15.12）個/視野、（241.63±19.02）個/視野、（305.75±24.12）個/視野，三組間差異均有統計學意義（P＜0.05）。②內源性BrdU陽性細胞分化：本實驗中選擇雙側大腦腦片上、中、下、左、右5個隨機視野進行檢測比較，三組間三種蛋白表達率比較，差異均有統計學意義（P＜0.05），見表2。

3 討 論

目前認為石菖蒲抗癲癇作用機制為[7]：通過降低興奮性氨基酸的含量，保護腦細胞；通過降低海馬神經元內NMDAR1的表達水平，降低細胞表面NMDAR1密度，和（或）抑制其活性，進一步降低大腦皮層的興奮性，提高癲癇發作的閾值，抑制NMDA引起的興奮性神經毒性導致的癲癇發生發展；通過延長驚厥潛伏期以及延緩驚厥發生時間抑制脊髓興奮；抑制腦內興奮性氨基酸類神經遞質谷氨酸的釋放，進而影響腦內c-fos基因的表達；通過提高Bcl-2的表達，抑制癲癇誘導的神經元凋亡；通過清除自由基，組織過氧化物形成，減少一氧化氮的神經毒性，對腦細胞也具有良好的保護作用；可以逆轉癲癇幼鼠運動行為即空間學習記憶的能力損傷。本研究顯示，石菖蒲煎劑干預可以明顯降低PTX癲癇模型大鼠癲癇發作次數和發作級別（P＜0.05），明顯減少其腦電頻率及腦電波幅（P＜0.05）；同時，大鼠學習記憶功能得到明顯的改善（P＜0.05）；本研究還發現石菖蒲能促進大鼠內源性神經干細胞的增殖、遷移及分化（P＜0.05），以改善腦電活動而達到抗癲癇作用。

正常情況下，成年嚙齒類動物大腦中有新生神經元不斷產生，以補充已經缺失的神經元，這樣成年后大腦神經元數目才能保持相對穩定[8]。盡管在正常狀態下成年大鼠的神經再生水平很低，但大腦在不同的病理狀態下試圖進行自我修復，如癲癇、腦缺血和創傷等病損狀態可以上調腦室下區和海馬等部位的神經干細胞活性，全腦性和局灶性腦缺血能夠有效地誘導海馬齒狀回的神經再生[9-10]。但內源性NSCs數量有限，在大多數情況下，僅由內源性NSCs產生的神經組織不足以替代損傷后缺失或損傷的神經組織。而石菖蒲具有多種藥理作用，可以促進癲癇鼠內源性NSCs遷移、增殖、分化，其機制可分為NSCs內在因素和外在因素，包括Wnt信號通路、Notch信號通路、Janus激酶信號轉導通路等，尚有某些細胞因子的參與[10]。我們推測石菖蒲促進癲癇鼠內源性NSCs遷移、增殖、分化的機制與其可以穩定內環境有關外，還可能與調控上述信號通路或刺激一些關鍵的細胞因子產生有關，有待于進一步研究證實。

由于受到倫理學的限制，目前，諸多研究都致力于外加刺激以促使內源性NSCs的自身激活。而石菖蒲在誘導NSCs增殖和分化上顯示出巨大的潛力，提示石菖蒲具有較強的抗癲癇應用價值。

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［3］劉妍，陳文強，黃小波.癲癇病的中醫藥經方治療及辨證論治概述［J］.北京中醫藥，2011，30（8）：638-640.

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［5］陳樂真，屠凌嵐.石菖蒲的化學成分與藥理研究進展［J］.浙江實用醫學，2008，13（3）：222-225.

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［7］石瑜，鄧艷春.石菖蒲抗癲癇作用及其機制的研究進展［J］.中國新藥雜志，2012，21（4）：385-389.

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Effect of Water Decoction of Rhizoma Acori Tatarinowii on Epilepsy Rats'Brain and Cognitive Function LI

Haifeng，ZHAO Yanting，WANG Hui，et al.The Children's Hospital affiliated to Zhejiang University School of Medicine，Hangzhou（310003），China

Objective：To explore the effect of the water decoction of rhizoma acori tatarinowii on brain neurogenesis and cognitive handicap of epilepsy in rats.Methods：Thirty SD rats were randomly divided into 3 groups，including control group，model group，and intervention group.Epilepsy model was established by picrotoxin in the model and intervention groups.Rats in the intervention group was given the water decoction of rhizoma acori tatarinowii of 10 mg/（kg·d）for 30d.Saline was given in the same way as described in the intervention group to the control and model groups.Studies on SVZ and DG region of BrdU positive cells in rat brain and immunohistochemical detection and Morris water maze experiment were carried out.Results：Morris water maze results showed that escape la tency time of the model group was longer than that of the intervention group and the control group（P＜0.05）.In spatial probe test，the percentage of the swimming time of the model group was significantly lower than that of the intervention and control groups（P＜0.05）.Cortical EEG results revealed that the Rhizoma acori tatarinowii interven tion improved the cerebral cortex stimulation threshold（P＜0.05）.Brdu+cell number of the intervention group signif icantly increased as compared with that of the model group（P＜0.05）.Conclusion：Epilepsy rats start the self-protection mechanism，and the rhizoma acori tatarinowii intervention can obviously enhance the protection mechanism.

rats epilepsy rhizoma acori tatarinowii cognitive

2013-06-10

表2 各組腦內BrdU陽性細胞Nestin、GFAP、TUJ1表達率比較

注：三組間比較，P＜0.05

組別正常對照組癲癇模型組石菖蒲灌胃組n/只10 10 10 Nestin/% 81.75±5.15 63.19±5.27 55.81±5.02 GFAP/% 10.17±3.00 20.75±3.59 23.93±2.80 TUJ1/% 2.14±1.16 7.12±2.21 17.12±2.50

浙江省中醫藥科技計劃項目（No.H20091187）