核酸檢測技術在無償獻血者血液篩查中的應用

白艷菊

應用核酸檢測(NAT)技術不僅能檢測出窗口期HBV、HCV、HIV感染,還可以避免病毒變異、免疫沉默性感染等造成的漏檢,在歐美等發達國家早在上世紀90年代,核酸檢測(NAT)作為常規技術納入獻血者篩查[1]。2012版《血站技術操作規程》規定經血傳播感染的檢測方法將HBV、HCV、HIV核酸檢測方法納入到常規模式當中[2]。吉林市紅十字中心血站是第二批進行核酸檢測的試點單位。自2012年4月17日開始對無償獻血者的血液進行HBV、HCV、HIV核酸檢測(NAT)現報告如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源與處理 2012年4月17日至2012年11月27日留取本站無償獻血者經兩遍ELISA檢測合格和單項陽性待檢的22688份無償獻血者標本,血液采集后留取5 ml血液置于NAT專用分離膠試管中,采集后4 h內3000 r/min離心20 min,置于2～8℃冰箱保存。

1.2 儀器 上海科華核酸血篩系統：Hamilton Microlab STAR匯集提取儀；7500擴增檢測系統儀；數據分析系統；脫蓋離心機。 酶免檢測系統： STAR加樣器；FAME全自動酶免分析儀；離心機；LisWell系統。

1.3 試劑 HBV、HCV、HIV核酸提取試劑和檢測試劑均為上?？迫A廠家提供。酶免試劑盒：抗-HCV(科華/新創 )、HBsAg(科華 /新創 )、抗 -HIV(萬泰 /麗珠 )、抗 -TP(麗珠/科華)以上試劑都是經國家批檢合格并在有效期內使用。

1.4 ELISA法對酶免標本進行血清學檢測。用STAR加樣器加樣,用FAME全自動酶免分析儀對HBsAg、抗-HCV、抗-HIV、抗-TP進行檢測, 采用不同廠家試劑不同人員進行兩次檢測。LisWell系統判讀。雙試劑初篩反應性判為陽性,單試劑初篩反應性雙孔復檢反應性判為陽性,雙試劑非反應性判為陰性。共有22688份ELISA檢測合格和待查標本進行核酸檢測。對核酸判為陽性的標本,再次從血袋取血重新檢測酶免。

1.5 核酸擴增檢測 當天進行ELISA檢測,第二天將ELISA檢測合格和待查標本進行核酸檢測。核酸標本在脫蓋離心機3000 r/min離心20 min,在生物安全柜內擺到標本架上,用Hamilton Microlab STAR進行全自動8個標本匯集到一個pooling里；之后進行提?。患拥街修D板；再轉移到加了反應液的反應板；貼膜在7500擴增檢測系統進行擴增。檢測HBV、HCV和HIV3個項目。出現陽性結果的八混樣管,再次進行單人份核酸檢測,還是陽性的標本判為核酸檢測陽性。

2 結果

在22688份核酸標本中,共檢出6例ELISA法陰性、NAT陽性標本。其中有5例是HBV陽性、一例是HIV陽性。再留取相應血袋血再檢結果相同。ELISA法篩查,漏檢率HBV是0.022% 、HIV是0.0044%。對ELISA法陰性,核酸檢測HIV陽性的標本的獻血者進行了跟蹤驗證,結果 2012年5月22日, 酶免結果 (S/CO值)0.00/0.04(試劑為珠海麗珠 /試劑為北京萬泰)結果陰性 。核酸結果(CT值)匯集管結果：28.0 ； 單檢結果(CT值)25.1 核酸檢測結果為陽性。2012年5月29 日,對此獻血者重新抽血,酶免結果 (S/CO值1.08/2.18(試劑為珠海麗珠/試劑為北京萬泰) 酶免結果為弱陽性 核酸單檢結果(CT值)：16.7 核酸檢測結果為陽性 將此樣本稀釋1000倍 核酸單檢結果(CT值)25.99。核酸檢測結果為陽性。追蹤驗證證明此獻血者為HIV窗口期。

3 討論

所謂“窗口期”是指從感染病原開始直至用某種檢測方法能夠檢測到該病原存在的這一段時間,血清學抗原抗體檢測的“窗口期”較長。在目前使用的ELISA檢測試劑的條件下,HBsAg、抗-HCV、抗-HIV的平均“窗口期”分別為56 d、82 d、22 d,而采用核酸檢測技術(NAT)HBV、HCV、HIV的平均“窗口期”可分別縮至25 d、59 d、11 d[3]。我國現在采用ELISA方法檢測HBsAg、抗-HCV、抗-HIV,吉林地區HBV漏檢率0.022%；HIV漏檢率0.0044%這說明現有的ELISA檢測方法存在“窗口期”漏檢的危險,NAT技術可以縮短病毒窗口期,降低經輸血傳播病毒的風險。在西方國家,有10萬人,年因輸入“窗口期”血液導致的HBV、HCV、HIV感染分別達2.70(95%CI：0.32～9.77),2.41(95% CI：0.29-8.70)和 4.06(95% CI：0.82～11.85)萬人 /年[4]。

本研究中,在2012年4月17日至2012年11月27日,篩查22688份ELISA法檢測陰性的標本,用NAT檢測篩查出1例HIV陽性和5例HBV陽性標本,ELISA檢測陰性標本,HBV“窗口期”發生率0.022%,HIV“窗口期”發生率0.0044%,沒有檢測出HCV,說明NAT能有效檢測出ELISA漏檢的病毒早期感染標本。NAT方法經過大量研究證實,其靈敏度,精確度和準確度已符合對ELISA“窗口期”標本的檢出要求對病毒載量大于等于50 IU/ml HCV、HIV檢出陽性率可達100%[5]。由此可見酶免試劑盒質量在不斷提高,患者輸血后感染疾病的風險已經很低,但由于我國是HBV感染率較高的地區,ELISA“窗口期”漏檢是當前影響血液安全性進一步提高的瓶頸,單純抗原或抗體血清學檢測不能有效保證血液安全。ELISA方法篩查陰性的血液仍有漏檢的可能。對輸血安全造成隱患,因此為了進一步提高血液的安全性,有必要在我國目前常規的ELISA的血液篩查中引進NAT檢測來保證輸血安全。

[1] 任芙榮,核酸檢測技術在國內外血液篩查中的應用.北京醫學,2008,40(8):561-564.

[2] 衛醫政發[2012]1號附件.《血站技術操作規程》.

[3] 王迅,鄧嵐,張穎,等.核酸擴增技術(NAT)在上海血液篩查中的初步應用.中國輸血雜志,2003,16(3):157-160.

[4] 趙全壁,蔡淑霞,劉玉磊.新疆伊犁哈薩克地區無償獻血人群中HIV HBV和HCV的核酸檢測.中國艾滋病性病。2010,16(6):539-606.

[5] 任芙蓉,劉長利,呂秋霜,等.病毒核酸檢測在獻血者篩查中的應用.中華檢驗醫學雜志,2004,27(9):596-599.