代謝組學在中藥質量與藥效研究中的應用

譚小燕，王毅，黃靜

(1.重慶三峽醫藥高等專科學校，重慶 萬州 404120； 2.四川大學 華西藥學院，四川 成都 610041；3.西南交通大學，四川 成都 610031)

代謝組學在中藥質量與藥效研究中的應用

譚小燕1，2，王毅1，3，黃靜2*

(1.重慶三峽醫藥高等專科學校，重慶 萬州 404120； 2.四川大學 華西藥學院，四川 成都 610041；3.西南交通大學，四川 成都 610031)

代謝組學是20世紀90年代末期發展起來的一門新興學科，著重研究生物整體、器官或組織的內源性代謝物質的代謝途徑及其所受內在或外在因素的影響及隨時間變化的規律。隨著發展，代謝組學在藥物研發、中藥研究與評價、臨床診斷、毒理學研究、微生物與植物、營養科學等領域中的應用越來越廣泛。本文主要綜述代謝組學的研究手段與方法在中藥質量控制研究和中藥藥效研究中的應用狀況，并展望其在中醫藥研究領域的應用前景。

代謝組學；中藥；質量控制；藥效研究；模式識別

代謝組學(metabonomics)的概念由英國帝國理工學院Jeremy K Nicholson教授基于長期對生物體液的研究于1999年提出，定量測量生物系統對病生理刺激和基因修改所做的與時間相關的多參數代謝應答[1]。實際最早來源于20世紀70年代由Devaux等人提出的代謝輪廓分析(metabolic profiling)[2]。20世紀90年代后期，Oliver Fiehn在植物代謝分析的基礎上提出了代謝組學(metabolomics)的概念，之后很多植物化學家開展了這方面的研究[3-4]。目前國際上形成了metabolomics和metabonomics兩大代謝組學主流領域。一般認為，metabolomics是通過定性和定量地分析生物體內所有代謝物組成來研究生物代謝途徑的一種技術，而metabonomics研究的是生物體在病理生理刺激或基因修飾下其所有代謝物質在不同時間的動態變化規律。前者一般以細胞為研究對象，后者更注重動物的體液和組織。

我國擁有豐富的中藥資源，有藥用植物11 146種，藥用動物1 581種和藥用礦物80種[5]。中藥產業是我國的傳統產業，中醫中藥理論無論是在診斷、藥理或者毒理方面都凝聚著歷史的智慧。但是中藥卻一直在國際上得不到肯定，關鍵在于中藥材及其中藥產品的“安全、有效、穩定、可控”問題的解決難度大，其原因主要在中藥本身成分的復雜性和中藥與人體作用的復雜性。中藥材、中藥飲片、中藥復方及中成藥等的質量直接影響臨床療效，而中藥材的質量卻是中藥質量控制關鍵的第一步。中藥材的質量好壞與所含化學成分直接相關，目前對中藥組成成分的系統性測定和控制是中藥材質量控制的薄弱環節。中藥的多組分實質就是藥用植物的多種代謝產物的集合，其組成、含量和存在狀態等受產地、氣候、采集季節及后處理等多方面因素的影響。代謝組學不但可以用于分析中藥中各種組分的類型、含量和狀態隨各種因素和時間的變化，還可以定量地對其進行評價，從而實現對其質量的控制。

中藥及其復方的有效性沒有被國際醫藥主流市場所接受，其根本原因是中藥理論未被國際廣泛接受。目前中藥尤其是復方藥效的評價主要采用化學藥藥理評價方法，難以體現中藥作用的特點和優勢。中藥發揮藥效簡單講就是中藥的化學組分相互作用，這些化學組分再與人體作用，調節、改善或刺激人體產生不同的代謝產物，從而出現防病、治病、無效或產生毒性等系列表征的過程。代謝組學的核心思想是通過內源性代謝物的變化來觀測中藥對機體所產生的整體效應，其思想具有與中醫理論整體觀念相一致的特點，并可根據代謝物組圖譜的變化，發現生物標志物，闡明中藥的整體效應，包括協同作用等。所以將代謝組學的方法應用到中藥藥效評價研究中具有重要意義。

1 代謝組學的研究手段與方法

代謝組學研究的特征是設法分析盡可能多的代謝組分。其研究一般包括樣品采集和制備、代謝組數據的采集、數據預處理、多變量數據分析、標志物識別和途徑分析等步驟[6]。生物樣品可以是植物的提取物、尿液、血液、組織、細胞和培養液等，采集后首先進行生物反應滅活、預處理；然后運用核磁共振、質譜或色譜等儀器檢測其中代謝物的種類、含量、狀態及其變化，得到代謝輪廓或代謝指紋；而后使用多變量數據分析方法對獲得的多維復雜數據進行降維和信息挖掘，采用模式識別法如主成分分析(PCA)、偏最小二乘法-判別分析(PLS-DA)等，識別出有顯著變化的代謝標志物，并研究所涉及的代謝途徑和變化規律，以闡述生物體對相應刺激的響應機制，達到分型和發現生物標志物的目的[6-7]。

2 代謝組學在中藥質量研究中的應用

我國有藥用植物近12 000種，中藥資源在不到20年的時間里已經銳減至6 000余種，400種常用藥材中有20%以上已處于短缺狀態。市場上的“道地藥材”多是“有其名、無其實”，還有相當一部分中藥材由野生改為人工繁育后，其產品質量發生了量或質的改變。為確保中藥資源的數量和質量，已經建立了上百個中藥材規范化種植基地，但其質量控制缺乏科學的手段。生物的個體特征除決定于先天遺傳因素外，還要受其存在環境的諸多影響，這些內外因素決定了生物個體的總體特征——代謝表型。對植物藥野生株和人工繁育株的代謝表型、不同外界環境影響下的活性化合物代謝途徑和相關代謝網絡進行系統的研究，將有利于解決遺傳育種和品質改良中效率低下、目標模糊等問題。應用代謝組學技術研究中藥種質資源代謝表型，將為中藥資源的可持續發展和利用提供科學依據和保障。

現階段，我國中藥材及中藥制劑的質量主要依據《中國藥典》2010年版一部規定的常規方法進行控制，包括性狀鑒別、顯微鑒別、理化鑒別、薄層色譜鑒別等，對多種中藥或制劑采用單指標或多指標的化學成分的測定來控制質量。雖然這種把已知的主要成分或有效成分作為指標予以檢測控制的方法比過去有很大的突破和進步，但從中醫藥的觀點來看，指標成分的控制難以真正控制中藥的功效。對于在中醫理論指導下的中藥，尤其是復方制劑，檢測任何一種活性成分均不能反映其所體現的整體療效，分析越細，目標越縮小，離中藥的整體療效距離越遠。中醫辨證施治用的是藥味而非某個化學成分，麻黃素與麻黃、甘草酸與甘草、人參皂苷與人參對中醫來說完全是兩回事。又如黃連和黃柏均含小檗堿，但測定小檗堿的含量說明不了中醫用藥的不同，中醫也絕不會將兩者相互替用；六味地黃丸中鑒別熊果酸含量不能證明里面有山茱萸，倘以山楂投料也可鑒別出熊果酸且絕對合格。可見中藥的功效是中藥飲片、中成藥方劑內含物質群的整體作用結果，只針對某一兩個化學成分，顯然遠遠不夠[8]。在這種情況下，采用代謝組學的方法最大限度地從中藥中獲取有關化學成分的信息，從整體上評價中藥的質量成為研究趨勢。

近年來，由于分析技術突飛猛進的發展，從常用的紫外、紅外等光譜技術到色譜及其聯用技術、核磁共振等都得到了充分的應用；數據處理技術也相應地從直觀數據比較發展到了基于計算機軟件的模式識別技術。代謝組學在中藥鑒別和質量研究中的應用越來越廣泛，在中藥材、中藥飲片以及各種類型的中藥制劑的質量控制中紛紛采用。

Hyung-Kyoon等[9]用1H-NMR對野生型和過表達水楊酸合成基因的轉基因煙草(Nicotianatabacum)的葉片和葉脈進行了研究，利用主成分分析方法得到NMR圖譜，僅通過兩個主成分就對樣品達到了明確的鑒別。此實驗提供了一種有效的不需過多步預處理程序的區分野生和轉基因植物的方法。

Kim等[10]對3種麻黃植物Ephedra進行了1H-NMR指紋圖譜分析，通過主成分分析找到了它們之間的代謝物差異，證明了NMR指紋圖譜分析是植物化學分類學的一個有力工具，從而對中藥材的鑒別提供了一條新的思路，并為其實現質量的全面控制帶來了可能。

王麗等針對沙棘屬植物的3個種5個亞種的21個樣品，以1H-NMR獲得總提物的全成分譜，再采用主成分分析和聚類分析方法，對不同種和不同亞種樣品進行了種間分析，對同一亞種樣品進行了種內分析。結果顯示：不同種樣品可以得到完全區分，同一亞種樣品具有很好的整體相似度，分析結果與植物分類學基本一致。此外，通過載荷圖發現不同含量的黃酮是引起鑒別的主要化學成分。該方法豐富了沙棘屬的植物分類學內容，提供了一種新的質量控制手段[11]。

譚小燕等[12-13]以1H-NMR技術測定不同產地的麥冬和4個不同基原種的川貝母的全成分信息，并采用模式識別法中的PCA、PLS-DA和聚類分析法進行識別分析，能有效地鑒別出各不同產地的麥冬樣本和不同基原種的川貝母，還建立了基原種預測模型。田祥琴等[14]在測定中藥復方制劑潔爾陰洗液1H-NMR指紋圖譜的基礎上，采用模式識別法中的PCA、PLS-DA和聚類分析法，分析圖譜，對2005～2007年各個批次的潔爾陰洗液樣品進行分析，建立了一種全面合理控制潔爾陰洗液產品質量的新方法。羅喬奇等采用1H-NMR采集不同道地產區川白芷樣品的信息，用模式識別中的主成分分析法分析不同川白芷樣品的數據，結果不同產地川白芷樣本間存在微小的差異，但總體趨于一致。其中，以遂寧地區所產川白芷樣品的變化最小，穩定性最好，分析結果與公認的川白芷的道地性相吻合。說明1H-NMR-PR分析方法可客觀、快速、有效地鑒別川白芷的道地性，也可為其他中藥材的道地性分析提供參考[15]。羅喬奇等[16]還采用1H-NMR-PCA法對川白芷硫熏樣本和非硫熏樣本進行了分析比較，發現差異明顯，并建立了PCA主成分預測模型用于鑒別川白芷偽劣樣本。

由于產地、采集時間以及加工方法的不同，加上環境污染等因素，中藥及許多植物藥在質量上可能存在很大差異。采用代謝組學這一系統生物學技術來提高中藥的質量控制水平，可為中藥的質量控制提供科學的依據。FIEHN O在植物代謝組學方面做了大量的研究[17]。有研究者用代謝組學的方法研究氣候等生長環境對中藥化學成分譜的影響，同時研究其質量控制方法[18]。中藥質量控制方面，代謝組學在中藥指紋圖譜朝著綜合、整體方向發展的基礎上又有了新的發展。

3 代謝組學在中藥藥效研究中的應用

中藥所含成分的復雜性使得其治療作用也是一種多系統、多靶點、多層次的作用，具有整體、綜合、動態及多樣性的特點，即這些化合物之間也有“君臣佐使”相互協同的作用關系，如何將中醫的獨特療效轉化為有效證據，闡明這種復雜的作用機制是中藥研究的一個難點和重要任務。對于中醫藥來說，首先要證明有效。然而，在什么方面有效、有效的標準如何確定，是當前中醫藥走向世界最需解決的問題，而中藥的“質量控制”技術也必須與“藥效的優劣”相聯系才有意義。許多研究者長期使用化學藥的指標評價體系來衡量中藥的療效，以此來表明中藥的有效性和科學性，然而由于中藥的特殊性使得采用這一體系出現諸多問題。如：中藥作用的溫和性和多靶點性使得中藥很可能在單一的關鍵藥效指標上無法與化學藥相比，如果由此認為中藥無療效或療效不好，就忽視了中藥的整體性，對中藥很不公平。如今，醫藥工作者試圖建立符合中醫中藥特色的藥效評價體系。

伴隨生命科學的發展，特別是系統生物學的出現，使得生命科學進入整合性研究時期。代謝組學是研究生命網絡重要組成部分代謝物的一門學科，代謝處于生命活動調控的末端，比基因組學、蛋白質組學更接近表型。中藥作用生命網絡的不同層次、不同靶點都會引起與之相關的一系列代謝物在濃度及相對組成上發生變化，通過現代分析手段測定這些相互關聯的變化，可以從整體上把握中藥的作用特點，進而通過代謝物的變化追溯到相關的蛋白質及基因表達的變化，從更高層次上闡明中藥的作用機制。

中藥進入人體發揮作用的基本環節是藥物分子與細胞之間各種組分的直接或間接的相互作用。中藥化學成分復雜，單味藥材就有很多個化學成分，更何況中藥復方，其復雜性和整體性決定了確定其有效成分的難度。但從機體的角度來看，機體本身是一個極其復雜的巨大系統，每個系統中都包含著多因素的問題。疾病的發生大多數也是通過多種途徑導致整體功能紊亂的過程，中藥有效成分進入人體進而發揮多成分、多靶點、多途徑的作用，必然會引起整個生命網絡從遺傳信息到整體功能實現中的分子、細胞、器官、整體多個層面的結構與功能狀態變化，這些變化會體現在相關代謝物在量上的改變。因此，可以內源性代謝物表達為指標進行中藥復方有效成分多組分、多環節、多靶點治療調整作用的研究。采用代謝組學來研究中藥的藥效是一個新生事物，也是一種發展趨勢。

至今將代謝組學用于中藥藥效研究的例子很多。如：天津藥物研究院[19]在研究參麥注射液的作用物質基礎時，發現該中藥能夠激發機體形成洋地黃樣的多肽物質，發揮洋地黃樣物質作用，是緩解心衰的物質基礎。Solanky等對10只SD大鼠給予22 mg劑量的表兒茶酸，并收集給藥前后大鼠的尿樣，采用基于NMR技術的代謝組學技術平臺，并結合主成分分析的數據處理方法研究了表兒茶酸(一種類黃酮)對大鼠生化代謝的影響。研究表明，給藥后大鼠尿液中牛磺酸、檸檬酸鹽及二甲胺等內源性代謝物的濃度降低。對給藥后不同時段收集的尿液進行分析，表明給藥后8 h對代謝的影響明顯，而且表兒茶酸對生化代謝的影響是可逆的。這一研究結果表明，代謝組學技術可以檢測到天然產物對生命體新陳代謝的影響，雖然表兒茶酸是一個來源于天然植物的單一化合物，但此方法可用于中藥藥效研究[20]。Wang等采用代謝組學的方法研究了甘菊對人體生化代謝影響，采用高分辨NMR技術集合模式識別方法，進行了為期6周的研究，對志愿者分別收集給藥前、給藥期間及給藥后的各兩周的每日尿樣。結果顯示，給藥前尿樣與給藥期間尿樣中內源性代謝物的含量有比較大的差別；代謝軌跡分析表明，甘菊對人體生化代謝有比較持久的影響，停止給藥后，藥效依然持續了很長一段時間。這一研究結果表明，雖然環境因素及志愿者個體差異較大，代謝組學的方法依然能夠有效地評估甘菊這種含有多種成分的復雜體系對人體生化代謝的影響[21]。譚小燕等[22]基于代謝組學的方法開展了黃連解毒湯治療氨基半乳糖(D-Galn)誘導的急性肝損傷大鼠的藥效學評價方法研究，不同時間段采集模型組、正常組和給藥組的血液樣本，通過1H-NMR技術采集提取信息，再通過主成分分析等手段進行模式識別研究，發現正常組與模型組的血清樣本呈明顯差異，在分析圖上呈明顯兩大區域，而給藥組隨著給藥時間的延長，呈現由模型組區域向正常組靠近的明顯趨勢。由此可見，對于黃連解毒湯藥效的評價，盡管暫時無法說明是什么物質或成分起了作用，但可以初步確定其具有療效，此探索將是用于中藥及復方篩選的一個新思路與方向。李云士還聯合天津急腹癥研究所利用代謝組學方法與技術，采用雙盲法進行了兩種中藥復方治療膿毒癥的藥效評價，結果與臨床長期觀察使用結果一致。這次試驗對代謝組學方法用于中藥及其復方的藥效評價、新藥研發初步篩選具有重要意義[23]。

4 小結與展望

代謝組學是新藥研究開發的重要組成部分，其應用涵蓋了新生物標志物的發現、新藥篩選、安全性實驗等[24]。運用具有反映整體思想的、先進的代謝組學方法來研究中藥，對控制中藥質量，搞清中藥的物質基礎、作用機理、作用靶標、藥效作用、組方依據、配伍規律和毒副作用以及對中藥種質資源等進行研究，是十分必要的，它有可能使有著幾千年歷史、以經驗為基礎的中藥治病向以科學方法和標準為基礎的現代化中藥治病轉變，從而對中醫藥事業的長遠和健康發展產生十分深遠的積極影響。

目前，代謝組學研究的主要困難在于樣品和研究對象的復雜、多樣和多變性。當前代謝組學研究的局限性主要體現在幾個方面：①缺少“全能型”分析技術。對某一物種、某個組織或其細胞中所有的代謝途徑中的所有代謝產物同時進行全面的高通量的定性和定量分析，在理論上行得通，但尚沒有任何一種分析技術能夠同時對代謝組中的所有化合物進行分析。②缺少功能完善的代謝產物數據庫和相應代謝物組數據的標準值。③非實驗性因素干擾研究結果。各種生理因素，如飲食、健康狀態、年齡、晝夜節律、壓力、遺傳變異和動物品系均可影響生物標本的代謝成分，為分析結果帶來難度。除嚴格控制實驗條件外，還需要尋找更加靈敏的檢測手段和深入的數據分析方法。④生物標志物的結構鑒定難。如何從大量的代謝產物中找出特異性的生物標志物，決定了其能否在臨床領域廣泛應用。⑤檢測所需的儀器設備價格昂貴，操作人員的專業性強，也限制了這一技術的推廣。隨著科學技術的進步，技術平臺要以開發聯用技術為核心，并不斷發展和完善適合不同分析目的的樣品前處理、數據信息提取和模式識別系統，結合化學計量學和生物信息學，經過堅持不懈的努力，逐步建立并完善代謝組學研究技術平臺。

代謝組學在中醫藥研究領域應著手開展幾方面研究：①研究植物源中藥種質資源代謝表型；②評價單味中藥安全性；③研究常用復方中藥配伍的科學性；④建立中藥代謝數據信息庫。由于代謝組學研究的自身復雜性，整體上仍處于初期發展階段，還需要進一步在技術體系和研究思路上進行創新和突破。但隨著科技進步，健康觀念、醫學模式、醫療模式的全面轉變，個體化診療、個體化用藥以及亞健康、慢性非傳染性疾病的防治成為醫學研究的重點。采用代謝組學相關技術與方法進行中醫藥研究，用現代術語闡釋中醫“因人制宜”、“治未病”等獨特的思維方式和治療方法，將為中醫藥的現代化和國際化發展開辟新的方向。

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TheApplicationofMetabolomicsinResearchofTraditionalChineseMedicineQualityandPharmacodynamics

TAN Xiao-yan1，2，WANG Yi1，3，HUANG Jing2*

(1.ChongqingThreeGorgesMedicalCollege，Wanzhou404120，China;2.WestChinaSchoolofPharmacySichuanUniversity，Chengdu610041，China;3.SouthwestJiaotongUniversity，Chengdu610031，China)

Metabolomics is an emerging discipline which developed in the end of the 1990s.It focuses on biological overall organ or tissue metabolic pathways of endogenous metabolites，the rules of changes caused by internal or external factors.With the technology development，metabolomics is more and more widely used in drug research，Traditional Chinese Medicine research and evaluation，clinical diagnostics，toxicology studies，microorganisms and plants，nutrition science.This article reviews the application status of metabolomics research tools and methods in the study of Traditional Chinese Medicine quality control and pharmacodynamics，and the prospects of their application in Traditional Chinese Medicine.

Metabolomics；Traditional Chinese Medicine；Quality control；Pharmacodynamics research；Pattern recognition(PR)

2013-06-18)

*

黃靜，教授，博士生導師，研究方向：天然藥物(中藥)生物活性成分、體內吸收代謝的NMR分析研究；Tel：(028)85503045，E-mail：huangj_pharm@scu.edu.cn