凝血功能與非小細胞肺癌相關機制研究進展

李艷華 綜述 魏素菊 審校

在過去的30年中，相關研究已經證實凝血系統極大地促進了腫瘤的進展和轉移。50%的癌癥患者存在凝血功能的異常，轉移性病變中凝血功能異常的概率高達90%[1]。凝血系統參與細胞從休眠狀態、非血管化腫瘤轉化到高轉移表型的多次相互作用。腫瘤將凝血系統活化到較高水平，則其具有更強的侵襲性生物學行為。Armand Trousseau教授于1865年首先報道了惡性腫瘤與血栓形成的相關性，腫瘤患者體內往往呈高凝狀態，有并發血栓性疾病的潛在風險。靜脈血栓栓塞癥（venous thrombo embolism, VTE）已成為導致腫瘤患者死亡的第2位原因，其中深靜脈血栓栓塞（deep venous thrombosis, DVT）與肺血栓栓塞（pulmonary thrombo-embolism, PTE）是實體惡性腫瘤最常見的并發癥[2]，并且在肺癌患者中發病率較高[3]。肺癌已是世界上發病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一[4]，不同病理類型及分期的肺癌其VTE的發生率不同，腺癌是鱗癌的2倍-3倍，非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）是小細胞肺癌的1.5倍-2.1倍，而遠處轉移的患者較局限病灶者高4倍-6倍[5]。肺癌通過多種復雜機制破壞機體內凝血和抗凝血之間的動態平衡，從而導致機體的凝血功能紊亂，這不僅與腫瘤的生長、浸潤、侵襲、轉移以及并發血栓性疾病等密切相關，而且還直接影響肺癌患者的預后。凝血功能與肺癌密切相關，本文就凝血系統各個組分在NSCLC發生發展中的病理生理學機制的最新研究進展進行綜述。

1 組織因子（tissue factor, TF）

TF是位于細胞表面相對分子量為47 kDa的膜蛋白，是凝血級聯反應過程中主要的激活因子。正常的內皮細胞不表達TF，而在組織損傷、炎癥或腫瘤等病理情況下，腫瘤壞死因子-α、白介素-1β等可誘導血管內皮細胞、腫瘤細胞或單核/巨噬細胞大量表達TF。TF與FVII結合，形成TFFVIIa復合物，從而激活FX、FIX，啟動外源性凝血途徑。TF負責腫瘤微環境中局部凝血酶的形成和纖維蛋白的沉積，從而影響腫瘤和宿主細胞之間多種細胞相互作用。

癌細胞是一個促凝血刺激因素，其促凝機制包括細胞表面TF的表達[6]。腫瘤特定類型的致癌轉化導致癌細胞TF的上調，提高腫瘤微環境的促凝特性，促進腫瘤的進展、血管生成和轉移[7]。TF可以通過蛋白酶活化受體（protease-activated receptors, PARs）家族介導信號的轉導，PARs分為PAR-1、PAR-2、PAR-3和PAR-4四種亞型。TF-FVIIa復合物激活腫瘤細胞表面PAR-2[8]或整合素，通過MAPK及JNK信號轉導通路上調血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）表達，同時抑制抗血管生成蛋白如凝血酶敏感蛋白-1（thrombospondin-1,TSP-1）的表達[9]。TF通常是粘附到細胞表面，但它也可以定位于血液中由血管內細胞如血小板、血管內皮細胞、白細胞以及腫瘤細胞表面脫落的亞微米泡的表面。這些囊泡被稱為微粒（microparticles, MPs），多項研究發現，血漿中MP-TF的濃度或MP-TF的促凝活性與VTE的風險甚至與VTE的復發呈正相關。另一研究[10]發現MP-TF與癌癥患者的死亡率相關，而與其血栓形成無明顯關聯。TF和整合素β1都定位于MPs，MP與整合素β1的連接可以作為一種粘附分子，促進MP持續地結合于細胞外基質（extracellular matrices, ECMs）如膠原蛋白和纖連蛋白，因此促進MP-TF的凝血活性[11]。TF也可以通過一個稱為選擇性剪接的TF（alternatively spliced TF, asTF）的剪接異構體促進腫瘤的血管生成。asTF可以調節內皮細胞的功能，并通過上調粘附受體來誘導白細胞的募集[12,13]。asTF與整合素α6β1和αvβ3結合，調節內皮細胞的遷移并促進體內腫瘤的活動[11]。TF的過表達是腫瘤相關血栓形成的一個重要因素，并促進原發腫瘤的生長[14]。研究[15]表明，在肺癌轉移的早期階段，癌栓的形成對于癌細胞的生存是必要的。

研究[16]發現NSCLC中TF的表達是升高的，而且與腫瘤的分期相關。對NSCLC原發腫瘤的分析表明，TF抗原與VEGF的表達和血管生成直接相關；TF的表達與生存時間呈負相關[17]。在一組NSCLC細胞系中TF的下調減少了裸鼠試驗腫瘤的生長[18]。TF、基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase, MMP）的表達以及粘附在癌癥轉移中是高度相關的，研究[19]表明TF表達小細胞肺癌H69細胞的可逆性生長表型。

2 凝血酶

凝血酶原（prothrombin)（又稱FII）釋放凝血酶原片段1+2（prothrombin fragment 1+2, F1+2）產生凝血酶。凝血酶是一種功能強大的蛋白水解酶和促凝化合物，能夠增強腫瘤細胞對細胞因子的增殖反應，增強腫瘤細胞對血小板（PLT）的黏附及細胞基質的侵襲，促進腫瘤血管形成和腫瘤微環境的組織重建。肺癌F1+2水平升高，VTE發生的危險性增加[20]。在小鼠模型中，凝血酶原和纖維蛋白原的不足、小鼠血小板的損傷、血小板凝血酶受體PAR4缺失和內皮凝血酶敏感蛋白[21]對凝血酶的調節，直接或間接抑制凝血酶，從而降低了腫瘤細胞的轉移潛能。

凝血酶通過PARs介導信號轉導，通過MAPK、ERK和PI3-K信號通路，上調VEGF、MMP-2、IL-8和整合素等的表達，促進腫瘤的生長、浸潤及轉移[22]。PARs中PAR-1和PAR-2是主要的凝血酶受體，在腫瘤組織及微環境中表達增高。凝血酶和PAR-1結合，上調PLT衍生生長因子、PLT激活因子及其受體的表達，激活PLT，促進腫瘤的生長和轉移[23]。凝血酶激活MMP-2，破壞基底膜，促使內皮細胞在新的腫瘤纖維蛋白基質中增殖。

3 纖溶系統和抗凝系統

3.1 纖溶系統 在腫瘤生長、血管生成和凝血級聯反應激活過程中，纖溶系統也被激活。這個過程涉及纖維蛋白的溶解和防止有缺陷的腫瘤血管中的血栓形成。纖溶系統包括血纖維蛋白溶酶酶原（plasminogen, PLG），它可轉化為有活性的血纖維蛋白溶酶。纖溶酶負責纖維蛋白的降解，也可活化MMPs，從而降解細胞外基質。D-二聚體是交聯的纖維蛋白在纖溶酶作用下裂解產生的一種特異性的代謝產物，其存在能夠表明體內有纖維蛋白形成和溶解，即血栓形成和溶解。D-二聚體是纖溶過程的一個敏感的標記物，高D-二聚體濃度水平的肺癌患者較低水平者預后差[24]。

纖溶酶原可由兩個不同的纖溶酶原激活劑（組織型纖溶酶原激活劑（tissue type plasminogen acitivator, tPA）和尿激酶型纖溶酶原激活劑（urokinase type plasminogen activator, uPA）活化為纖溶酶。t-PA介導的纖溶酶原的激活主要參與循環中纖維蛋白的溶解；而u-PA介導的纖溶酶原的活化主要與細胞外蛋白的水解相關，如組織重構和腫瘤的侵襲[25]。纖溶酶原激活系統（尤其是u-PA）在腫瘤的侵襲和轉移中起重要作用。u-PA/u-PAR系統通過增加細胞外基質的降解和局部蛋白的水解，促進腫瘤的侵襲；同時可通過促血管新生作用和u-PA/u-PAR信號通路使腫瘤向更加惡性的表型轉化。uPA高表達或與內皮素-1（endothelin-1, ET-1）同時高表達的肺腺癌患者具有較長的術后生存時間[26]。uPAR由三個同源結構域I、II、III組成。研究[27]表明，血清中uPAR（I-III）和uPAR（I）是根治性手術NSCLC患者的獨立預后因素。

纖溶酶原/纖溶酶系統激活后，通過α2-抗纖溶酶調節纖溶酶的水平[28]，通過纖溶酶原激活劑抑制劑（如PAI-1、PAI-2、PAI-3）或間接通過凝血酶激活纖溶抑制劑（thrombin-activatable fi brinolysis inhibitor, TAFI）控制纖溶酶原的活化水平。PAI-1的抗纖溶作用有助于循環腫瘤細胞與內皮細胞的粘附，并啟動腫瘤細胞外滲及轉移灶形成的過程。PAI-1通過上調c-jun/ERK、Bcl-2、Bcl-XL和下調Bcl-X8、Bax，促進腫瘤細胞的存活[29]。PAI-1還通過抑制FAS/FASL信號通路調節細胞凋亡，并促進血管生成[30]。研究表明，在肺成纖維細胞中，PAI-1可通過增加細胞內的Ca2+濃度及促進細胞周期的進行，從而激活ERK和AKT信號通路[31]。99例肺腺癌患者的uPA和PAI-1對總生存預后影響的研究表明，PAI-1高于平均水平則預后差；低水平PAI-1、高水平uPA-PAI-1復合物的患者比高水平PAI-1、低水平uPA-PAI-1復合物者有更好的生存[32]。

3.2 抗凝系統 抗凝血酶III（ATIII）和維生素K依賴性凝血抑制劑（蛋白C和S）與增強的促凝血活性相抗衡。ATIII是最重要的天然凝血酶抑制劑。活化的蛋白C（APC）使FVa和FVIIIa失活，蛋白S（PS）作為其輔助因子發揮抗凝作用。APC可以與受體PAR-1或EGFR結合，啟動MAPK和PI3K信號途徑促腫瘤的生長，與細胞外MMP-2和MMP-9作用降解ECM，從而促進腫瘤轉移[33]。

肺癌轉移是基于復雜的相互作用，觸發腫瘤及其周邊環境的信號通路，調節腫瘤細胞的存活及器官定植[34]。血管內皮細胞蛋白C受體（endothelial cell protein C receptor,EPCR）是高度表達于血管內皮的跨膜受體，其主要的天然配體是蛋白C和APC。APC與EPCR結合后增強抗氧化、抗炎及抗血栓形成的功能。肺腺癌是肺癌最常見的組織學亞型，轉移是其常見的并發癥[35]。研究發現I期肺腺癌患者的EPCR水平與其生存期有明顯的相關性；高水平的EPCR與無疾病進展生存（progression free survival, PFS）明顯相關，這提示EPCR是肺腺癌疾病進展的獨立危險因素；腫瘤細胞表達EPCR，APC與EPCR結合，促進腫瘤細胞的存活，提高了肺腺癌的轉移活性，并抑制肺腺癌細胞的凋亡，有助于肺癌的轉移[36]。

4 血細胞和細胞因子

4.1 血小板 研究[37]發現30%-60%的腫瘤患者有血小板增多，血小板增多在肺癌患者中較普遍。腫瘤細胞所致的血小板聚集高度支持腫瘤轉移[38]，血小板與腫瘤細胞的相互作用是腫瘤成功轉移必不可少的一部分。血小板通過釋放其顆粒中的各種生長因子和趨化因子（如PDGF、IGF-1、VEGF等），上調其它促血管新生介質（包括基質細胞衍生因子CXCL12、MMP-1、MMP-2和MMP-9）的表達，刺激腫瘤的生長，影響血管生成[39,40]。最近研究[41]表明，血小板在腫瘤轉移的早期階段也發揮重要的作用，活化的血小板釋放大量轉化生長因子β（TGFβ），激活TGFβ/Smad和NF-κB信號轉導通路，誘導腫瘤細胞類上皮間質轉化（epithelialmesenchymal transition, EMT），提高腫瘤細胞的轉移潛能。TGFβ是一個細胞因子超家族成員，能夠調節一系列細胞功能，在肺疾病（包括肺癌）中起重要作用。TGFβ1通過MEK1/ERK和PI3K/Akt信號通路介導肺癌的轉移[42]。血小板衍生微粒（platelet derived membrane microparticle,PMP）可表達和轉運功能性受體，刺激細胞因子的釋放，激活細胞內PI3K-Akt、ERK信號轉導通路，促進腫瘤血管生成和轉移[43]。Gil-Bernabe等[44]研究指出TF誘導的血小板聚集與巨噬細胞的募集直接相關，血小板血栓快速募集單核巨噬細胞是肺轉移成功的關鍵。

4.2 單核/巨噬細胞 血漿蛋白通過高滲透性的腫瘤血管漏出，可以激活炎癥反應和腫瘤誘導的外源性凝血途徑。炎癥刺激可誘導腫瘤血管內皮細胞的促凝行為。單核/巨噬細胞和T細胞等受到刺激后產生某些細胞因子如IL-1β、TNFα，上調內皮細胞表達TF或PAI-1，促進腫瘤的進展。在NSCLC中IL-6的血清水平與腫瘤的進展和生存相關[45]。TF激活凝血系統，促進腫瘤細胞血凝塊的形成，引發單核/巨噬細胞的聚集，從而促進腫瘤細胞的存活，這是引發腫瘤轉移的一個組成部分[15]。研究[46]表明，腫瘤有效的轉移必須有單核/巨噬細胞的參與，巨噬細胞不僅具有抗腫瘤活性，而且也可以促進腫瘤的發生和進展。

4.3 VEGF 血管生成、凝血反應和炎癥是與癌癥的發生和發展高度相關的復雜的過程。內源性血管生成抑制劑TSP-1和內皮抑素維持生理性的血管生成平衡。內皮抑素是由血小板釋放的，可抑制內皮細胞的遷移，誘導細胞凋亡，從而減少腫瘤的血管生成。TSP-1通過調節VEGF的分泌，限制血管生成過程。癌癥患者VEGF的上調和TSP-1的下調，導致血管生成控制失調，促進了腫瘤的血管生成和炎癥反應。腫瘤缺氧微環境中VEGF表達上調，通過增加VEGF-A的生成誘導血管生成。在血管內皮細胞，VEGF通過其受體VEGFR-2活化MMP，從而激活uPA，導致蛋白水解及腫瘤細胞浸潤[47]。此外，VEGF也上調內皮細胞uPA、uPAR的表達。在NSCLC患者中，TSP-1的mRNA高表達與較長的PFS相關[48]。NSCLC患者的VEGF、其可溶性受體1（VEGFR1）和2（VEGFR2）、IL-6、TF等血管生成、炎癥和凝血標志物水平是升高的，高水平的VEGF和低水平的TSP-1與肺癌預后差相關[49]。

5 展望

在快速增長的肺癌人群中，凝血功能紊亂普遍存在，部分患者出現高血凝狀態并發VTE，嚴重影響患者預后。我們已經掌握了凝血級聯反應、纖溶及抗凝系統、血細胞、細胞因子等在肺癌進展和轉移中的許多功能和作用機制，然而腫瘤細胞與凝血系統相關的新的分子機制有待進一步的研究，這將有助于針對肺癌和相關凝血功能紊亂進行預防、早期診斷和適當的治療，可能會對易感人群的臨床預后產生明顯的影響。