BIM基因多態性與復治晚期非小細胞肺癌EGFR-TKI治療療效的關系

鄭蕾 林寶釵 宋正波 謝發君 洪衛 馮建國 邵嵐 張沂平

目前，肺癌在全球的發病率和死亡率均居惡性腫瘤首位，其中80%為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC)，大部分患者在確診時已是晚期[1]。BR.21[2]、TITAN[3]和INTEREST[4]臨床研究顯示了厄洛替尼和吉非替尼在晚期NSCLC二三線治療中的療效。 基于上述大規模的前瞻性多中心臨床研究，表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor, EGFR-TKI）已被批準用于晚期NSCLC的二三線治療，并且NCCN指南指出在二線及二線以上治療時，可以不依據腫瘤基因的突變狀態。然而，由于個體的差異和腫瘤的異質性，在二三線靶向治療中，EGFR-TKI的療效各異。近年來有研究發現血標本中細胞凋亡相關基因多態性與NSCLC及其它惡性腫瘤的治療療效及預后有密切的相關性。在惡性腫瘤的發病機制中細胞凋亡機制缺陷占有重要的地位。BCL-2基因家族是細胞凋亡的進程中重要的死亡決策者。目前已發現的BCL-2基因家族成員超過25種[4]：根據其結構和功能可以分為三類：第I類具有抗凋亡作用，包括BCL-2、BCL-XL、BCL-W等。第II類具有促凋亡作用， 包括BAX、BAK等，包含3個BCL-2同源結構域BH1、BH2、BH3。第III類具有促凋亡作用并且只含有BH3結構域，包括BID、BAD、BIM、BIK等。這些BCL-2家族基因所編碼的蛋白可以形成同源或異源二聚體或多聚體，聚集在線粒體膜上而形成孔道來破壞膜的穩定性，引起細胞色素C（cytochrome C, CytC）的釋放并最終導致細胞凋亡的發生。

BIM基因作為BCL-2家族成員之一，其編碼的蛋白BIM 的全稱為BCL-2 interaetion mediator of cell death，是參與細胞死亡的重要介質。其最初是由Hsu[5]等在用酵母二元雜交的方法篩選與MCL-1相互作用蛋白質時，從卵巢cDNA文庫中發現的一種蛋白，都只含有BH3結構域，并且和MCL-1、BCL-2及BCL-XL等抗凋亡因子相互作用而誘導凋亡，因此將其基因命名為BCL-2相關卵巢死亡基因（BCL-2-related ovarian death gene），簡稱BOD。在人類基因組中，BIM基因位于2q12-q13[6]。在NSCLC中，BCL-2家族成員蛋白介導的EGFR基因突變癌細胞能夠激活PI3K/AKT/mTORC和MER/ERT信號通道，決定著細胞的存活或者凋亡。BIM基因的BH3域缺失，則容易引起凋亡受阻[7]。

Ng等[8]研究發現在BIM基因上存在缺失多態性。在慢性粒細胞白血病（chronic myeloid leukemia, CML）中，BIM基因多態性患者對EGFR-TKI（伊馬替尼）治療療效劣于無BIM基因多態性者（P=0.02）。在EGFR基因突變的NSCLC患者中，BIM基因多態性患者對EGFR-TKI的療效也劣于無BIM基因多態性者（P=0.027），而使用BH3類似物，則可以逆轉對EGFR-TKI的耐藥。Nakagawa[9]研究報道東方人群在EGFR基因突變的NSCLC患者中，BIM基因多態性率占12.9%，并且有BIM基因多態性的肺癌細胞對吉非替尼的療效較BIM無多態性的療效差，當吉非替尼與BH3類似物HDAC抑制劑聯合可以逆轉因BIM基因多態性對EGFR-TKI的耐藥。

本文對BIM基因多態性與復治晚期NSCLC EGFR-TKI治療療效的相關性進行研究。

1 材料與方法

1.1 研究對象 本研究入選的123例晚期NSCLC患者，于2009年1月1日-2012年10月1日入住浙江省腫瘤醫院化療科，均經細胞病理學或組織病理學確診為IIIb期或IV期的NSCLC，治療前經CT掃描證實有可測量病灶，所有患者既往接受過一至二線的化療，失敗后均接受吉非替尼或厄洛替尼的二三線靶向治療。入組標準：①年齡18歲-80歲；②經組織病理學或細胞病理學證實的IIIb期或IV期NSCLC患者；③有可測量或可評估的病灶；④能隨訪，依從性好；⑤所有患者既往均接受過一至二線的化療，失敗后均接受吉非替尼或厄洛替尼靶向治療；⑥簽署知情同意書。排除標準：符合以下任意一條標準者，均不得入選：①僅有不可測量病灶者；②嚴重或未控的內科疾患或感染；③既往或同時合并其它惡性腫瘤；④精神異常。

1.2 實驗主要試劑、耗材 血液基因組中量提取試劑盒、2×LAmp MasterMix（含染料）、1 kbp Ladder、TAE Buffer（電泳緩沖液）（康為世紀公司）、BIM基因上游引物、BIM基因下游引物（上海基康生物技術有限公司）、西班牙瓊脂糖（西班牙）。

1.3 實驗主要器材 4oC冰箱（MPR-311D，SANYO，日本），-20oC冰箱（MDF-330，SANYO，日本），-70oC超低溫冰箱（MDF-3826W，SANYO，日本），低溫高速電動離心機（Neofue 23R，上海力申科學儀器有限公司），漩渦混合器（XW-80A，上海醫大儀器廠），PCR儀器、電泳槽、成像儀（Bio-Rad公司，美國），紫外分光光度儀（ND-1000，Nano Drop，美國），各種規格移液器（eppendorf3111，EPPENDORF，德國），各種規格Eppendorf管、8聯管、96孔板（Axygen，美國）。

1.4 實驗步驟

1.4.1 標本采集 收集123例入組的所有患者血標本，在采集血標本之前均告知患者知情同意，并簽知情同意書，均在服用靶向藥物開始之前留取。抽取外周靜脈全血2 mL，置入乙二胺四乙酸鈉（EDTA）抗凝管，4oC冰箱短時間存放。用離心機低速離心 （3,000 rpm, 10 min），然后分離白細胞層，置于-70oC超低溫冰箱貯存備用。

1.4.2 外周血DNA提取 采用康為世紀公司的血液基因組中量提取試劑盒（1 mL-5 mL）BloodGen Midi Kit，按照說明書從所留取的肺癌全血標本中提取DNA。

1.4.3 引物設計 按照引物設計的原則，參照文獻設計引物序列[9]。由上海基康生物有限公司制備。上游引物：5’-AATACCACAGAGGCCCACAG-3’，下游引物：5’-GCCTGAAGGTGCTGAGAAAG-3’。

1.4.4 PCR反應體系 在超凈工作臺冰盒上進行加樣：2×LAmp MasterMix（含染料）12.5 μL，上游引物1 μL（濃度均為10 μM），下游引物1 μL（濃度均為10 μM），DNA 2 μL，去離子水8.5 μL。本實驗已設空白對照孔，每個樣本均設置復孔。

1.4.5 PCR反應條件 96oC預變性30 s，94oC變性15 s，60oC退火60 s，68oC 10 min延伸，進行29個循環，68oC 20 min終延伸。4oC取出，低溫保存，備用。

1.4.6 瓊脂糖凝膠電泳體系 將TAE緩沖液、1%瓊脂糖、溴化乙錠（0.5 μg/mL）在電壓120 V的瓊脂糖凝膠電泳體系電泳60 min。

1.5 療效評價標準 療效評定采用實體瘤療效評價標準（Response Evaluation Criteria in Solid Tumors, RECIST）[10]，分為完全緩解（complete response, CR）、部分緩解（partial response, PR）、穩定（stable disease, SD）和進展（progressive disease, PD）。客觀緩解率（objective response rate,ORR）=（CR +PR）/（CR+PR+SD+PD）×100%。疾病控制率（disease control rate, DCR）＝（CR+PR+SD）/（CR+PR+SD+PD）×100%。

1.6 隨訪和生存分析 隨訪采用門診、電話或書信方式，末次隨訪時間為 2012年11月30日。無進展生存期（progression-free survival, PFS）定義為患者自接受吉非替尼或厄洛替尼靶向治療開始至疾病進展、死亡或不良反應不可耐受。對于在隨訪截止日期無進展的病例，在統計時作截尾數據處理。

1.7 不良反應評定標準 不良反應按照NCI-CTC3.0 ，抗癌藥物常見不良反應分級標準[11]評定，分為0度-4度。

1.8 統計學方法 應用SPSS 13.0軟件進行統計分析。療效及不良反應的關系采用Pearson χ2法，單因素分析采用Kaplan-Meier法及Log-rank檢驗，多因素分析采用Cox回歸。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 患者一般臨床特征 患者的一般資料，入組患者共123例，所有患者既往經過一至兩線化療失敗后開始二三線EGFR-TKI靶向治療，其中共48例患者服用吉非替尼（易瑞沙）250 mg，每天1次口服治療：75例患者服用厄洛替尼（特羅凱）150 mg每天1次口服治療。所有患者具體臨床特征詳見（表1）。

2.2 基因多態性檢測結果判定 因BIM基因多態性，經擴增后目的片段長度無多態性的野生型純合子型為4,226 bp，有多態性的包括缺失型和混合型，缺失型純合子型為1,323 bp，混合型為4,226 bp和1,323 bp兩個條帶都有（圖1）。

2.3 BIM基因多態性與EGFR-TKI治療療效的關系 所有樣本共123例，其中BIM基因無多態性，即野生型的患者有102例，療效評價無CR患者，PR 33例，SD 44例，PD 25例，ORR為32.4%，DCR為75.5%；BIM有多態性的患者21例，其中缺失型3例，混合型患者18例，無CR患者，PR 3例，SD 9例，PD 9例，ORR為14.3%，DCR為57.1%。在客觀緩解率上，BIM基因無多態性對比BIM多態性的患者（ORR: 32.4% vs 14.3%, χ2=2.746, P=0.098），差異無統計學意義；在疾病控制率上，BIM基因無多態性對比BIM多態性的患者（DCR: 75.5% vs 57.1%, χ2=2.931, P=0.087），差異無統計學意義（表2）。

表 1 患者的一般臨床特征Tab 1 General clinical characteristics of the patients

表 2 BIM基因多態性與EGFR-TKI治療療效的關系Tab 2 Relationship between BIM gene polymorphism and therapeutic efficacy of tyrosine kinase inhibitor

圖 1 BIM基因多態性檢測結果。在凝膠成像系統掃描中最右側為maker電泳通道，（左邊數起）第1通道為BIM基因缺失型是1,323 bp條帶，2、3通道為野生型是一條4,226 bp長條帶，4通道為混合型是4,226 bp和1,323 bp兩個條帶都有。Fig 1 BIM gene polymorphism detection result diagram. The rightmost of the gel imaging system is maker electrophoresis channel, (left in the cases) the first passage is BIM gene deletion whose bands is 1,323 bp,channel 2 and 3 is the wild-type whose band is 4,226 bp long, channel 4 is mixed-type having 4,226 bp and 1,323 bp two bands.

2.4 單因素分析PFS 本研究單因素分析中位PFS，女性長于男性（6.9個月 vs 4.5個月，χ2=7.077，P=0.008)；不吸煙者長于有吸煙史者（8.0個月 vs 2.5個月，χ2=15.277，P＜0.001）；病理類型為腺癌長于其它類型（7.0個月 vs 2.0個月，χ2=14.978，P＜0.001)； BIM基因為無多態性中位PFS長于BIM基因有多態性的患者（6.0個月 vs 3.5個月，χ2=7.035，P=0.008)，差異均有統計學意義，而其余臨床特征差異均無統計學意義（P＞0.05）（表3、圖2）。

2.5 多因素分析PFS 多因素分析結果顯示吸煙與否（P=0.030）、病理類型（腺癌與非腺癌，P=0.001）以及BIM基因多態性有無（P=0.037）為PFS的獨立預后因素，其余均為非獨立預后因素（表4）。

2.6 毒性反應 本研究結果顯示吉非替尼及厄洛替尼治療NSCLC中，不良反應中主要為皮疹和腹瀉。BIM基因無多態性I度-IV度皮疹62例，占60.9%，III度-IV度皮疹10例，占9.8%。BIM有多態性者I度-IV度皮疹12例，占57.1%，III度-IV度皮疹2例，占9.5%。BIM基因無多態性者I度-IV度腹瀉34例，占 33.3%，III度-IV度腹瀉9例，占8.7%，有多態性者I度-IV度腹瀉5例，占23.8%，III度-IV度腹瀉1例，占4.7%，差異均無統計學意義（P＞0.05）。其余少見的不良反應如乏力、間質性肺炎、肝功能損害等差異也均無統計學意義（P＞0.05）（表5）。

3 討論

BIM基因是BCL-2家族的促凋亡基因成員之一，其表達的蛋白屬于僅含BH3域蛋白（BH3-only protein），即前凋亡蛋白，廣泛表達于正常細胞，在造血細胞的內環境穩定、防止自身免疫及腫瘤的發生中有著極其重要的作用。在NSCLC及其它惡性腫瘤的靶向治療中，多項研究表明BIM基因與靶向治療的療效密切相關。

Li等[12]研究結果證實，對吉非替尼藥物敏感的NSCLC細胞株中，吉非替尼通過BIM蛋白表達數量明顯增加來增強對腫瘤細胞的殺傷作用，用RNA干擾技術沉默BIM基因后，原來敏感的腫瘤細胞則對吉非替尼耐藥，而通過影響BIM信號通道上的PI3K抑制劑 和MEK抑制劑聯合治療，能夠增加BIM蛋白的表達，從而克服對吉非替尼的耐藥。說明BIM基因在靶向治療藥物介導的腫瘤細胞凋亡過程中具有十分重要的作用。賀韋東[13]研究NSCLC細胞株的凋亡以及促凋亡蛋白BIM的表達，探討吉非替尼對其的影響。研究的細胞株為H1975的第20外顯子T790M突變，第21外顯子2573氨基酸位L858R突變， H1650細胞株缺失19外顯子缺失。吉非替尼誘導NSCLC細胞株凋亡，其中對H1650、H1975突變株的誘導凋亡率高于A549細胞株（P＜0.01），H1650的BIM表達隨吉非替尼濃度的增加而增強，H1975的BIM表達較高，而A549的BIM表達需要更高濃度的吉非替尼作用。結果表明吉非替尼可以使NSCLC細胞EGFR突變株細胞內的BIM蛋白表達增高，并且可能通過上調BIM的表達來誘導腫瘤細胞凋亡。Gong[14]研究EGFR基因突變的NSCLC對EGFR-TKI的耐藥機制。其中EGFR-TKI藥物對于EGFR基因突變的細胞作用引起凋亡通過激活凋亡caspase途徑，其中前凋亡蛋白BIM參與其凋亡過程密切相關。厄洛替尼誘導突變的細胞凋亡通過上調BIM水平，而在耐藥的細胞株中則BIM低表達。在體外研究通過RNA干擾技術沉默BIM基因則引起靶向耐藥，而BH3的類似物ABT-737能夠增加厄洛替尼介導細胞凋亡的敏感性。

表 3 單因素分析PFS結果Tab 3 Results of univariate analysis of PFS

表 4 多因素分析Tab 4 Multi-factor analysis

圖 2 單因素分析PFS與BIM基因多態性的關系Fig 2 Single factor analysis of the relationship between PFS and BIM gene polymorphism

表 5 BIM基因多態性與毒副作用的關系分析Tab 5 Analysis of the relationship between BIM gene polymorphism and side effects

Faber等[15]結果表明在EGFR突變的NSCLC患者EGFR-TKI治療中，BIM高表達中位PFS較低表達的長（P=0.001）。24例患者中19例接受EGFR-TKI一線治療，其余接受二線治療，15例患者BIM高表達，9例BIM低表達，BIM的水平與EGFR基因突變類型無相關性。按照RECIST其中PR患者13例，CR患者1例，客觀緩解率為64%，BIM低表達患者腫瘤瘤體平均縮小29%，而BIM高表達患者腫瘤瘤體平均縮小57%（P=0.04）。中位PFS在低表達患者短于BIM高表達患者。

本研究所有樣本共123例，其中BIM基因無多態性患者有102例，ORR為32.4%，DCR為75.5%；BIM有多態性的患者21例，缺失型3例，混合型患者18例，ORR為14.3%，DCR為57.1%。在疾病控制率上，BIM基因無多態性對比BIM有多態性，差異無統計學意義（DCR: 75.5% vs 57.1%, χ2=2.931, P=0.087），BIM基因為無多態性較BIM基因有多態性患者疾病控制率略好趨勢。Katagiri等[16]表明BIM基因缺失多態性可能是伊馬替尼治療慢性粒細胞白血病的標準。本研究結果首次發現了對于基因突變未明的中國人群的復治晚期NSCLC，BIM基因多態性與療效有相關性趨勢。

本研究單因素分析中位P FS，女性長于男性（P=0.008)；不吸煙者長于有吸煙史者（P＜0.001)；病理類型為腺癌長于其它類型（P＜0.001)，差異均有統計學意義。本研究結果與既往如IPASS、 OPITIMAL等大型臨床研究結果中EGFR-TKI在不吸煙、腺癌患者中療效較好相類似，是靶向治療的優勢人群。

本研究單因素分析BIM基因為無多態性中位PFS長于BIM基因有多態性的患者（6.0個月 vs 3.5個月，χ2=7.035，P=0.008）。本研究結果的多因素分析結果顯示BIM基因多態性為PFS的獨立預后因素。本研究結果進一步從臨床中證實了BIM基因多態性能夠作為預測EGFR-TKI治療的療效的指標之一。在EGFR基因突變未明的中國患者，BIM基因多態性所占的為17.1%，因不同人群不同種族肺癌治療的不同階段，可能會存在基因突變的差異，所含基因多態性的比例會有所差別。分析該部分BIM基因有多態性的患者缺失了BH3結構域，影響了細胞凋亡通路，對EGFR-TKI療效欠佳。本研究發現BIM基因型與不良反應差異無統計學意義。

本研究為回顧性研究，且樣本量有限，有待后續更進一步深入研究及期待前瞻性多中心的大型臨床研究為肺癌的治療提供更高級別的循證醫學證據。隨著各種基因分析技術不斷涌現，將有可能對癌癥患者的基因表達譜進行全面高通量分析，用靶基因患者預測抗腫瘤藥物的療效，更好的指導臨床個體化用藥，使臨床用藥更具針對性、高效性和安全性。