西妥昔單抗聯合塞來昔布對肺腺癌細胞KDR和AQP1表達的影響

夏洪剛 葉劍飛 白宏宇 王長利

肺癌是人類高發的惡性腫瘤，病死率在惡性腫瘤中居首位，其治療失敗和死亡的主要原因肺癌的侵襲和轉移，新生血管的生成在肺癌的侵襲和轉移中起著極其重要的作用[1,2]。近年來研究[3-6]表明水通道蛋白1（aquaporins 1, AQP1）和血管內皮生長因子受體II/激酶功能區受體（vascular endothelial growth factor II , VEGFR2/kinase domain receptor, KDR）在許多腫瘤及其血管內皮細胞均有表達升高，在促進血管生成和腫瘤細胞增殖中起著關鍵作用。本研究以肺腺癌A549細胞株為研究對象，觀察表皮生長因子受體（epithelial growth factor receptor, EGFR）單克隆抗體西妥昔單抗、環氧合酶-2（cyclooxygenase-2, COX-2）抑制劑塞來昔布單獨及聯用時對體外肺腺癌A549細胞增殖和凋亡及KDR、AQP1基因和蛋白表達的影響，探討兩者的協同關系及其機制，以期為臨床治療肺癌提供新思路和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 肺腺癌細胞株A549購自中國科學院上海細胞究所。RPMI-1640培養液、胎牛血清和胰蛋白酶均購自美國Gibco公司。SPB購自德國Merck公司，塞來昔布（Celecoxib，江蘇恒瑞制藥有限公司），西妥昔單抗（Cetuximab，德國默克公司），青霉素（100 U/mL）（北京化工廠），鏈霉素（100 U/mL）（Peprotech），5%四甲基偶氮唑藍（MTT溶液，上海華美生物工程公司）；流式細胞儀（COULTER XL, Coulter）；550酶標儀（美國Biorad公司），生物倒置顯微鏡（Olympus CKX4）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和實驗分組 肺腺癌細胞株A549購自中國科學院上海細胞研究所，培養在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液中，置飽和濕度5%CO2、37oC恒溫培養箱中培養。細胞以1×106個/100 mL培養瓶，常規培養24 h后如下分組進行藥物處理，實驗分組：對照組（PBS液1 mL處理組）；西妥昔單抗1 nmol/L組；塞來昔布25 μmol/L組；西妥昔單抗1 nmol/L+塞來昔布25 μmol/L組，藥物濃度見參考文獻[7,8]。

1.2.2 MTT比色實驗 在96孔板上按5×104個/孔接種A549細胞，如1.2分組，每組設三個平行重復孔，置于37oC、5%CO2的培養箱中培養48 h后，棄去培養液，生理鹽水漂洗一遍，每孔加MTT 20 μL（濃度為5 mg/mL），放置孵箱內4 h后棄上清加入10%的SDS（十二烷基磺酸鈉）200 μL，過夜。震蕩15 min，用全自動酶標儀（美國Biorad公司）檢測570 nm處的吸光度值（A值）。抑制率（%）=（A對照組-A實驗組）/（A對照組-A空白組）×100%。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞周期 收集如1.2分組的不同處理組細胞，調整細胞濃度為1×106個/L，冷PBS 洗滌2次，加入70%的冷乙醇（4oC）固定24 h。洗滌細胞，與含10 μg/mL RNA 酶的Tris-HCL緩沖液（pH7.4）共同孵育30 min。50 μg/mL碘化丙啶進行細胞DNA染色，1 h內通過流式細胞儀（COULTER XL, Coulter）；分析細胞DNA含量分布，計算出各個周期細胞的百分率。

1.2.4 Transwell小室侵襲實驗 在聚碳酸酯微孔濾膜上鋪Matrigel 50 μg/孔，在聚合好的小室下室加入10%的胎牛血清做條件培養液，在上室加入按如1.2分組處理過的A549細胞懸液100 μL（細胞總數為3×105個/L），置于培養箱中20 h后取出，用濕棉簽仔細擦掉上室中未穿過的瘤細胞，95%的乙醇固定5 min，PBS輕輕漂洗3遍，進行HE染色，自然涼干，將上室的聚碳酸酯濾膜沿邊緣用手術刀片小心取下，用樹脂膠固定于玻片上（膜內面朝上），封片；高倍顯微鏡下記數穿膜的A549細胞數，每膜記數上、下、左、右、中5個視野的侵襲細胞數，計算平均值，每組設三個濾膜。

1.2.5 RT-PCR檢測KDR、AQP1基因表達 將各組處理后的細胞懸液分別經離心半徑16 cm、 800 rpm、離心5 min收集細胞，棄去上清后置于1 mL勻漿器中，加入1 mL Trizol試劑后研磨（冰盒上操作）。進行RT-PCR分析。采用Trizol（Takara公司）試劑說明書介紹的方法提取組織總RNA，紫外分光光度計測定RNA含量，以總RNA為模板、Oligo（dT）為引物, 應用RT-PCR兩步法試劑盒（TaKaRa公司）將mRNA逆轉錄成cDNA，反應參數：30oC、10 min→2oC、30 min→99oC、5 min→5oC、5 min。所得cDNA -20oC保存。以反轉錄所得cDNA為模板，相關引物序列見表1。上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL，40 μL體系。擴增參數：94oC、2 min→（94oC、30 s→55oC、30 s→72oC、30 s）×45循環→72oC、5 min。取PCR產物經瓊脂糖電泳后用FR200圖像分析系統分析。

1.2.6 Western blot檢測KDR、AQP1蛋白表達 在RT-PCR提取后剩余物中，加入適量裂解液及蛋白酶抑制劑，4oC、以1,500 rpm離心30 min，取上清液。用考馬斯亮藍法測定蛋白含量后。將5%濃縮膠40 V衡壓1 h，10%分離膠60 V恒壓3.5 h，濕轉14 V恒壓14 h，37oC搖床封閉2 h，洗膜10 min，3次，轉印后加入一抗：KDR多克隆抗體（1:1,000）或AQP1多克隆抗體4oC過夜（1:1,000）；抗鼠β-actin（1:5,000）4oC過夜。次日加入二抗山羊抗兔抗體（1:700），37oC搖床孵育1.5 h，TTBS洗3次×5 min，TBS洗3次×5 min。將硝酸纖維素膜用發光液（Pierce，A、B各100 μL）充分潤濕后作用5 min，保鮮膜覆蓋，置暗盒中曝光5 min。顯影、水洗、定影后觀察結果，Quantity one圖像分析。目的條帶灰度值除以β-actin灰度值進行結果分析。

表 1 引物序列Tab 1 Primer sequences

表 2 各組A549細胞OD490值（Mean±SD, n=9）Tab 2 OD490 value after Cetuximab and Celecoxib inhibit A549 (Mean±SD, n=9)

1.3 統計學處理 采用SPSS 13.0統計軟件進行分析，計量資料以Mean±SD表示，兩組間比較用t檢驗，多組間比較用方差分析，協方差校正，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞形態學觀察 肺腺癌A549細胞在光學顯微鏡觀察，可見細胞生長旺盛，分布密集，大多呈多角形，細胞走向趨于一致，多角形細胞的胞體飽滿、有2個-3個扁平而長的突起，細胞核較大，呈卵圓形且多居中（圖1）。

2.2 各組A549細胞經處理后的OD490值 從表2 可以看出：Cetuximab單藥處理組抑制率為（30.6±1.2）%；Celecoxib單藥處理組抑制率為（29.8±1.4）%；而Cetuximab 1 nmol/L+Celecoxib 25 μmol/L組兩藥聯用的效果，抑制率為（61.4±2.2）%。說明兩者聯合作用具有協同效應。

圖 1 A549細胞光學顯微鏡下形態（×200）Fig 1 A549 morphology under the light microscope (×200)

2.3 流式細胞術測定細胞周期分布 如表3所示，Cetuximab組、Celecoxib組和Combination組G1期細胞明顯多于對照組，Combination組明顯多于Cetuximab 組和Celecoxib組，而S期細胞相應減少，差異有統計學意義（P＜0.05），M期細胞無明顯變化。表明Cetuximab 1 nmol/L+Celecoxib 25 μmol/L組兩藥聯用的效果優于單獨用藥。

2.4 A549細胞體外侵襲力的變化 如圖2所示，對照組A549細胞穿過濾膜的細胞數量較多，Cetuximab組、Celecoxib組穿膜細胞數明顯減少，Combination組穿膜細胞數最少。實驗結果表明Cetuximab 1 nmol/L+Celecoxib 25 μmol/L組兩藥聯用能更有效地降低A549細胞的侵襲力。

表 3 對各組549細胞周期的影響（Mean±SD, n=3）Tab 3 Cetuximab and Celecoxib effect on A549 cell cycle (Mean±SD, n=3)

圖 2 不同處理組處理后A549細胞侵襲能力的影響。和對照組比較，*P＜0.05；與Combination組比較，△P＜0.05。Fig 2 Changes of invasion ability of A549 cells in each group cells. Compared with control group, *P＜0.05; Compared with Combination group,△P＜0.05.

2.5 AQP1、KDR mRNA表達 經過相關處理后，AQP1 mRNA、KDR mRNA在Combination組表達量較Cetuximab組、Celecoxib組降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。較對照組明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05）（圖3）。

2.6 AQP1、KDR蛋白表達 給予相關處理后各組AQP1、KDR蛋白表達表達如下（圖4），經過相關處理后，AQP1、KDR蛋白在Combination組表達量較Cetuximab組、Celecoxib組降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。較對照組明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。

3 討論

圖 3 各組細胞AQP1 mRNA、KDR mRNA表達變化。與對照組比較，*P＜0.05；與Combination組比較，△P＜0.05。Fig 3 Changes of AQP1 and KDR mRNA levels in each group cells. Compared with control group, *P＜0.05; Compared with Combination group, △P＜0.05.

圖 4 各組細胞AQP1蛋白、KDR蛋白表達變化。與對照組比較，*P＜0.05；與Combination組比較，△P＜0.05。Fig 4 Changes of AQP1 and KDR protein levels in each group cells. Compared with control group, *P＜0.05; Compared with Combination group, △P＜0.05.

肺癌是一種臨床常見的肺部惡性腫瘤，其死亡率己占癌癥死亡率之首，可分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌，其中非小細胞肺癌占了到肺癌的85%以上。肺癌的侵襲和轉移是肺癌患者治療失敗和死亡的主要原因。而腫瘤血管的生成在腫瘤的浸潤和轉移過程中起著至關重要的作用[9]。因為腫瘤的持續生長必須依賴新生血管生成，大量的新生血管形成是體積＞2 mm的腫瘤繼續生長不可缺少的因素，沒有足夠的新生血管提供充足的養分，腫瘤的生長潛能將嚴格受到限制[10,11]。

近年來的研究[12,13]表明KDR及AQP1與腫瘤血管生成關系密切，不僅在血管內皮細胞表達KDR及AQP1，而且腫瘤細胞亦能表達。其中AQP1是腫瘤血管生成的一種新的促進因子，被認為是血管增生的一種標記物。目前大量研究表明許多腫瘤組織、癌細胞系及微血管內皮細胞中AQP1呈高度表達[14,15]，并且其表達量與腫瘤惡性程度有直接關系，惡性程度越高，AQP1表達量越高[16]，提示應用水通道蛋白（aquaporins, AQP）的抑制劑或抗AQP抗體降低AQP1的表達將會是新的治療肺腺癌手段。KDR也是腫瘤血管生成過程中主要的調控因子之一[17]。腫瘤細胞分泌血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF），除了以旁分泌的形式作用于血管內皮上的KDR，促進血管形成外，還以自分泌的方式作用于自身細胞上的KDR，直接促進腫瘤細胞生長。另外研究發現阻斷KDR表達可誘導腫瘤細胞凋亡。因此，抑制KDR表達，不僅可抑制腫瘤血管生成，而且也可阻止腫瘤細胞的生長從而阻斷肺癌的生長和轉移。故以KDR為靶點抑制血管生成進而控制腫瘤生長，對腫瘤治療和防止腫瘤遠處轉移也有重要意義。

近年來研究[18]表明，COX-2抑制劑塞來昔布對多種腫瘤細胞有抑制增殖、誘導分化、促進凋亡作用；西妥昔單抗是一種腫瘤分子靶向藥物，也廣泛應用于基礎和臨床研究[19,20]。本實驗將兩者聯合應用于A549細胞的體外培養，探討兩者對A549細胞KDR及AQP1表達的影響及對腫瘤細胞的抑制效果。研究發現在A549細胞系的體外作用中，西妥昔單抗和塞來昔布都具有一定的抑瘤效應，聯合應用時，二者具有明顯的協同效應，可進一步抑制細胞的生長和遷移。西妥昔單抗和塞來昔布單藥作用于A549細胞能夠明顯降低AQP1和KDR基因和蛋白的表達水平，兩藥聯合時降低AQP1和KDR基因和蛋白表達的作用更加明顯。提示降低AQP1 和KDR基因和蛋白的表達可能是兩者協同作用的分子機制之一。具體機制本研究分析認為與兩種藥物分別通過抑制COX-2及抗腫瘤作用改善微環境，進而使AQP1和KDR基因和蛋白表達降低。西妥昔單抗和塞來昔布聯合作用后細胞凋亡率更高（P＜0.01）；聯合用藥與單獨用藥相比，可使細胞發生明顯的G1期阻滯（P＜0.01），細胞侵襲力明顯降低。本研究顯示將西妥昔單抗和塞來昔布聯合應用于肺腺癌的治療效果更佳，能夠為臨床提供有益的思路。