一種新的細胞周期蛋白
——Cyclin Y的功能和分子機制的研究進展

趙曉婷 江妹 岳文濤

細胞周期素（cyclin）、周期蛋白依賴性激酶（cyclindependent kinase, CDK）、細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子（cyclin-dependent kinase inhibitor, CKI）是細胞周期調控的關鍵分子，廣泛存于真核生物細胞中，它們一起組成細胞周期的調控網絡[1,2]。近年的大量研究顯示，在細胞發生惡性轉化的過程中，除了癌基因與抑癌基因的正負調控之外，細胞周期調控分子也參與了細胞的癌變過程。從一定程度說，腫瘤被認為是一種細胞周期病，腫瘤的發生、發展與細胞周期調控的失調密切相關[3]。細胞周期素是一類隨著細胞周期變化呈現周期性出現和消失的蛋白，他們的共同特點是具有100個-150個氨基酸組成的周期素盒（cyclin box）保守序列，不同周期素可利用該序列結合不同CDKs，控制細胞周期啟動和關鍵監測點（check point），在細胞周期的不同階段發揮作用[1,4]。現有研究[5]表明幾乎所有已知周期素在在腫瘤發生和發展中都起到關鍵作用。細胞周期素E（cyclin E）在肺癌、乳腺癌、結直腸癌、肝癌中高表達，而細胞周期素D（cyclin D）與非小細胞肺癌、頭頸癌、胰腺癌、膽囊癌、乳腺癌等腫瘤發生相關[6,7]。近年來，陸續有一些新的周期素蛋白被發現，細胞周期素Y（cyclin Y, CCNY）即為其中之一。作為一種新發現的細胞周期素，cyclin Y極有可能在腫瘤的發生發展中具有重要的功能，現就cyclin Y的研究進展及其與腫瘤的關系做一綜述。

1 Cyclin Y的結構特點

Cyclin Y又稱CCNY、cyc-Y、周期素盒蛋白1（cyclin box protein 1）、周期素折疊蛋白1（cyclin fold protein 1）或周期素盒攜帶蛋白1（cyclin-box carrying protein 1），是近年來新發現的一種細胞周期蛋白。其編碼基因CCNY定位于10號染色體，全長3,968 bp，有10個外顯子、9個內含子。Cyclin Y蛋白含有341個氨基酸，分子量約為39KD，其中143-243位氨基酸高度保守，是CDK結合結構域，亦稱為周期素盒。最近，研究者發現了cyclinY的一種異構體——cyclin X（CCNX），除了缺失cyclin Y N末端54個氨基酸殘基外，其余蛋白序列與Cyclin Y序列完全相同[8]。

2 Cyclin Y的亞細胞定位

Cyclin Y的N端第二位氨基酸即甘氨酸為豆蔻酰化位點，將cyclin Y定位于細胞膜，而cyclin X的N末端由于缺少豆蔻酰化位點，在細胞中主要定位于細胞核[8]。中國科學院上海生化細胞所的研究人員成功將CCNY基因及其N端突變體克隆至真核表達載體pEGFP-N3、pEGFP-C2、pcDNA3-2HA和pMycN3中，發現野生型cyclin Y在半轉化型細胞HEK293T細胞中定位于細胞膜，N端豆蔻酰化位點突變的突變體在HEK293T細胞中定位于細胞漿和細胞核中[9]，這與Mikolcevic等[10]的研究發現是一致的。另外，Li[8]等將目的基因CCNX克隆至真核表達載體pCMV-Myc中，發現CCNX的N末端缺少豆蔻酰化位點在人肺癌細胞系H1299中主要定位于細胞核。在我們的研究中也得到了類似的結果，人肺癌細胞系H1299中外源性CCNX主要在細胞核表達。大量的研究顯示蛋白質的功能與其亞細胞的定位密切相關。例如，Lonardod等[11]發現在非小細胞肺癌中Maspin的胞質定位提示預后不良，若在細胞核內出現則預后較好。但是cyclinY與cyclin X之間的關系以及兩者在細胞中的內源性表達情況及定位尚不明確。

3 Cyclin Y的功能與分子機制

細胞周期（cell cycle）是指細胞從第一次分裂結束產生新細胞到第二次分裂結束所經歷的全過程，分為間期與分裂期兩個階段。間期又分為三期、即DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）與DNA合成后期（G2期）。M期即為細胞分裂期。細胞周期受到由細胞周期蛋白（也稱為周期素）、細胞周期蛋白依賴激酶和CDK抑制物構成的網絡系統調控，該系統針對多個細胞周期監測點嚴格控制細胞周期的運行[1,2]。例如cyclin D激活CDK4或CDK6掌控G1期的細胞生長[12,13]；Cyclin E作為CDK2的一個正向的調節亞單位，促使細胞進入S期[12,14]。現有的研究表明，細胞周期內有兩個階段最為重要即G1期到S期和G2期到M期。細胞周期的運行主要依賴于CDK，該酶通過與細胞周期蛋白相結合產生活性，促進細胞周期中G1期到S期和G2期到M期的轉變。

現有的研究[15]表明cyclinY高度保守，在調節細胞周期及轉錄過程中發揮重要作用。但是關于cyclin Y的功能和作用機制尚不清楚。目前CCNY基因功能在果蠅中研究比較清楚。在果蠅中CCNY基因命名為CG14939，在果蠅的胚胎發生中具有重要的作用，Cyclin Y基因突變后會導致果蠅生長遲緩，發育產生缺陷或畸形。Liu等[16]采用免疫共沉淀技術鑒定出Cyclin Y與果蠅Ecdysone-induced protein 63E（Eip63E）結合；Eip63E基因編碼5種高度相關、且具有CDK同源結構域的蛋白亞型,是果蠅中與cyclin Y結合的CDK。Davidson等[17]研究證實，膜定位的Cyclin Y與Eip63E結合，通過磷酸化LRP6 1490位絲氨酸活化Wg/Wnt信號通路，促使果蠅細胞通過G2期/M期檢查點進入M期。通過NCBI數據庫對Eip63E的cDNA序列進行比對，發現人類基因組中基因序列與Eip63E基因序列同源的有PCTAIRE protein kinase 1（PCTK1）、 PCTK2、PCTK3、PFTAIRE protein kinase 1 （PFTK1）、PFTK2、CDK5等。PCTAIRE激酶（PCTAIRE kinases, PCTKs）與PFTAIRE激酶（PFTAIRE kinases, PFTKs）屬于高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，在真核生物中高度保守，具有CDK2激酶結構域的同源序列,是近年來發現具有CDK功能的激酶，屬于cdc2相關的激酶，又名為CDK14[18,19]。與哺乳動物中，PFTAIRE具有Eip63E與cyclin結合的α-螺旋區的氨基酸序列的同源區，因此認為PFTAIRE是Eip63E的同源CDK[16]。Gary Davidson團隊的研究發現，在果蠅中，PFTK1可以使Wnt受體之一LRP6的1490位絲氨酸磷酸化，從而參與Wg/Wnt信號通路的活化[17]。

酵母雙雜交的研究結果說明， PFTK1可以與CCNY相互作用，而亞細胞定位分析說明細胞中CCNY的一種異構體定位于細胞膜上，因此，細胞膜上的CCNY可能通過與PFTK1的結合，將PFTK1固定在膜上，引起細胞膜蛋白LRP6的磷酸化[17]。作為細胞周期蛋白，CCNY在細胞中的水平隨細胞周期的變化而變化，在G2/M期水平達到最高；而LRP6 1490位絲氨酸的磷酸化水平也在G2/M期達到最高，這充分說明CCNY極可能通過PFTK1參與了Wg/Wnt信號通路的活化。但是，CCNY參與人類細胞周期調控的機理仍不完全清楚，胞漿分布的PFTK1如何轉至細胞膜與CCNY結合是需要解決的關鍵問題。而且，在人類細胞中，CCNY是否能夠與其他的CDK結合尚不清楚。

最近，Mikolcevic等通過免疫共沉淀及酵母雙雜交的方法證實另一個與Cyclin Y相作用的CDK，即PCTAIRE 1（PCTAIRE kinases 1, PCTK1)，又名CDK16，它與CDK14序列上高度同源；Cyclin Y依賴磷酸化作用與PCTK1相結合并使其共定位于細胞膜；另一方面，Cyclin Y增強了PCTK1激酶的活性，進而促進精子的形成[10,20]。

4 Cyclin Y與腫瘤

關于Cyclin Y在腫瘤中的功能及作用機制的報道比較少，與之相關的研究尚處于起步階段。根據已有的研究，CCNY與CCNX在腫瘤中的作用與分子機制可能有所不同。中科院上海生命科學研究院Jiang等利用Northern blot檢測了多種人體組織和細胞系，發現其中至少存在兩種Cyclin Y轉錄本，分別為4 kb和2 kb，4 kb轉錄本在所有檢測的組織和細胞系中低水平表達，2 kb轉錄本則在睪丸等細胞分裂旺盛的細胞中高表達，在骨骼肌、腦等組織中低表達，而在正常肺組織中無表達[9]。這說明2 kb Cyclin Y轉錄本更能夠促進腫瘤的發展，在腫瘤增殖調控中可能發揮重要的功能。但是，由于CCNX與CCNY相比，只是在N端缺少了54個氨基酸，已有的抗體的抗原表位均位于CCNY與CCNX的共有序列，所以在蛋白檢測方面很難將CCNY與CCNX區分開；而且，在已有的報道中，多應用RNA干擾技術（RNA interference, RNAi）對cyclin Y的功能進行研究，而RNA干擾的靶點也位于CCNY與CCNX的共有序列，所以難以將CCNY與CCNX的功能進行區分，大多數報道尚未對二者進行區分。

作者前期的研究結果發現CCNY基因在非小細胞肺癌腫瘤組織（n=60）和肺癌細胞系（n=12）中高表達，CCNY基因的表達與非小細胞肺癌的組織類型以及腫瘤的大小具有統計學差異；利用RNA干擾技術抑制CCNY基因的表達可顯著抑制H1299、95D肺癌細胞增殖的速度及小鼠體內成瘤的效率；CCNY基因沉默后肺癌細胞周期阻滯于G1/S期，從而顯著抑制肺癌細胞的體內外生長[21,22]。同樣，在直腸癌的研究中也有類似的結果，Ying-Tao等[23]通過質譜分析的方法篩選出Cyclin Y蛋白在轉移性的人直腸癌細胞系中顯著高表達；而且，高表達Cyclin Y能促進直腸癌瘤細胞的細胞增殖、遷移與侵襲，同時在腫瘤細胞的粘附、凋亡及腫瘤的免疫等方面發揮重要的作用，進而可能與直腸癌的遠處轉移密切相關。另外，Cyclin Y還能促進腦膠質瘤細胞的增殖。利用RNAi抑制CCNY表達可明顯抑制腦膠質細胞瘤細胞的增殖、克隆形成以及細胞周期的進程。綜上所述，Cyclin Y與腫瘤的發生發展可能密切相關，但是目前Cyclin Y在其它腫瘤中作用研究的很少[24]。

另外，研究表明與Cyclin Y結合的CDK PFTK1在腫瘤發生發展過程中可能發生重要的功能。Pang等[18]研究發現PFTK1在肝癌組織中高表達，PFTK1基因的表達與腫瘤的遠處轉移及微血管轉移密切相關；體外實驗亦證實PFTK1可能通過改變F-肌動蛋白的運動進而促進肝癌細胞的遷移與侵襲。Miyagaki等通過免疫組化的方法檢測了223例食管鱗狀細胞癌組織中PFTK1蛋白的表達，發現PFTK1蛋白不但在食管癌組織中高表達而且與食管癌的預后也密切相關；PFTK1過表達者的生存率明顯低于低表達者，同時對化療的耐藥性也顯著提高，提示其可作為有效的預后及化療療效觀察的因子[25]。這也說明Cyclin Y在腫瘤進展中極有可能具有重要的作用。

5 應用前景

目前越來越多的研究證實Cyclin Y作為細胞周期相關蛋白，其基因和編碼蛋白的異常，在胚胎發育、細胞周期進程及腫瘤發生發展中扮演重要的角色。但是目前對Cyclin Y的研究尚少，還存在不少的問題。例如：Cyclin Y在其它腫瘤中表達情況尚不明確；Cyclin Y與其它腫瘤相關基因的相互作用機制尚未十分清楚；Cyclin Y與腫瘤轉移的相關性還有待進一步明確；Cyclin Y在腫瘤中的功能與作用機制還亟需進一步的探索和研究。深入研究Cyclin Y不僅有助于揭示腫瘤的發生機制，并可為腫瘤的防治提供一個新的視點。