MICA基因多態性、巨細胞病毒感染與潰瘍性結腸炎的相關性

伍楚蓉 楊 文 黃紅東 羅 寧 (南方醫科大學附屬南海人民醫院腫瘤一科，廣東 佛山 5800)

炎癥性腸病(IBD)，包括克羅恩病(CD)和潰瘍性結腸炎(UC)，是病因不明確的慢性腸道炎癥，多在中青年輕發病，呈慢性反復發作過程，以黏血便、腹瀉、腹痛、消瘦和貧血為主要表現，嚴重時可發生中毒性巨結腸、腸穿孔、腸梗阻、腸出血及癌變等并發癥。雖然研究發現IBD的發生主要與腸道免疫應答異常密切關系，但是病因及發病機制仍不太清楚，目前國內外大多數學者認為是由于多因素相互作用所致，腸黏膜免疫調節異常、持續的腸道感染、腸黏膜屏障缺損、遺傳和環境等共同參與疾病的發生過程〔1，2〕。傳統的流行病學研究顯示IBD具有遺傳易感性，家族聚集現象、單卵雙生子同患率高于雙卵雙生子、猶太人發病率高以及UC易伴發一些免疫或遺傳性疾病等方面〔3〕。對中國人群的基因多態性分布以及與UC的相關性研究發現 MICA、MICB、CTLA-4、MTHFR 與 UC 相關〔4～6〕，未見其他基因與UC相關，這提示我國UC基因型分布與歐美國家不同，IBD遺傳易感性存在種族差異。

1 MICA基因多態性與UC的相關性

MIC(major histocompatibility complex classⅠchain-related gene)基因與MHC-Ⅰ類基因相連鎖，同源性很高，具有較高的基因多態性，但分子結構、功能和組織分布不同于經典的HLAⅠ類基因。MICA基因與HLA-B彼鄰，距HLA-B著絲粒端僅40 kb。MICA基因全長11 722 bp，編碼1 382 bp的轉錄子，包括6個外顯子(exon 1～6)。Exon 1編碼L前導肽，exon 2～4分別編碼細胞外α1、α2和α3結構域，exon5編碼跨膜 (TM)區，exon6編碼胞內區。在MICA基因的跨膜區發現了微衛星(GCT)。目前，已發現7個等位基因，分別命名為 A4、A5、A5.1、A6、A7、A9 和 A10，數字代表了 GCT 的重復數，A5.1 是由5個GCT重復順序再加上一個額外核苷酸插入成的序列(GGCT)，導致移碼突變，在TM區產生早現的終止密碼子，編碼胞內區截短的MICA分子。MICA等位基因與HLA-B基因的緊密連鎖，研究表明MICA已成為某些MHC相關的自身免疫性疾病的候選基因，如強直性脊柱炎、類風濕關節炎、系統性紅斑狼瘡、尋常銀屑病、Addison病、Behcet病、胰島素依賴性糖尿病、乳糜瀉病及IBD等〔7～12〕，而且在器官移植的相關性研究中也成為研究熱點〔13〕。盡管人類MICA基因多態性與多種自身免疫性疾病相關，但是這種多態性功能性相關機制仍然不明確〔14，15〕。

MICA蛋白主要分布在上皮細胞系中，尤其是胃腸道上皮細胞，多年研究結果顯示MICA可能是一種應激性蛋白標志，高溫、病毒或感染、DNA損傷等因素均可致細胞表面MIC蛋白表達增加。MICA的受體NKG2D為C型凝集素，是NK細胞上最常見的受體，在絕大多數γδT細胞、CD8+αβT細胞和NK細胞、激活的 CD4+T細胞表面上都可檢測到〔16～18〕。NKG2D 通過與感染的細胞、過度應激細胞、腫瘤細胞表面誘導產生的配體結合，從而激活 NK細胞，δγT細胞、CD8+T細胞表面以及CD4+T細胞發揮相應的殺細胞活性。NKG2D受體與轉接蛋白結合來分別傳遞協同刺激信號或完全激活信號〔19〕，NKG2D有兩種轉接蛋白，DAP10和DAP12，他們與NKG2D，DAP12細胞質區內含有免疫受體酪氨酸活基序(ITAM)，NKG2D受體與其結合產生完全激活信號;但是DAP10與DAP12不同，DAP10胞質區含有YxxM基序，NKG2D通過起產生協同刺激信號。NK細胞在激活的情況下產生完全和協同兩種激活途徑對細胞產生殺傷作用。通過DAP10產生的信號能夠增強NK細胞的細胞毒活性，通過DAP12傳遞活化信號可以促進NK細胞產生INF-γ，消除腫瘤、殺傷體外培養的腫瘤細胞〔20〕。NKG2D 受體與MICA結合部位是在MICA分子胞外區，故MICA 2～4外顯子多態性對疾病的發生有比較重要作用，MICA微衛星多態性決定胞內區尾端的缺失與否，對形成可溶性MICA分子相關。

研究發現MICA*A5.1等位基因編碼的蛋白與其他的6個相關的等位基因的表達產物相比，缺失了胞內區和部分跨膜區。Suemizu等〔21〕發現了MICA*A5.1等位基因對應的截短型的MICA分子表達于細胞表面的頂端，而全長型的MICA分子則表達于細胞表面的基底外側，該部位正好與上皮細胞內的T細胞和NK細胞相互作用。對MICA*A5.1等位基因編碼的MICA分子在細胞頂端。國外學者把MICA*A5.1等位基因轉染到宿主細胞里，發現這種胞內區截短的MICA蛋白表達分布于頂端細胞表面，而MICA*A5等位基因對應的全長型MICA蛋白表達分布于基底細胞外側。并通過定點突變發現Leu-Val(344-345)是MICA蛋白表達于細胞基底部的必要條件。而MICA*A5.1等位基因對應的氨基酸序列終止于第304位，因此可以解釋為什么MICA*A5.1等位基因對應的蛋白表達與細胞的位置發生改變〔21〕。Leu-Val(344-345)是MICA在細胞膜上穩定的必要氨基酸序列，在MICA分子細胞質尾部，在腸上皮細胞表面，也是NK和TIELs，因此也是與之接觸發揮作用的首要條件，因此，MICA*A5.1不正確的跨膜位置似乎有道理的解釋為免疫功能的缺陷基礎和在天然免疫中的不利作用。研究報道，MICA*A5.1與許多自身免疫性疾病相關，如糖尿病、乳糜瀉、類風濕關節炎、白塞病等相關，但是MICA*A5.1如何影響自身免疫的進程仍然不明確。Gambelunghe等〔22〕報道MICA*A5.1基因與SLE正相關，但是起引起自身免疫性疾病疾病的具體發病機制仍然不明確。

NK細胞、δγT細胞、CD8+T細胞在感染、移植及其他的應激性細胞的免疫監視中而不激活自身免疫反應，這是NK細胞和CD8+T細胞的內在特性。NK細胞的激活受抑制性受體和激活性受體控制，這些受體的配體在一些潛在的靶細胞表達，正常情況下，NK細胞大量的抑制性受體識別正常細胞的負性調節的控制而不被激活。在感染、移植或應激情況下通過減少抑制性受體配體或者增加激活性受體配體的表達克服這些自身耐受的抑制，這些激活性配體和抑制性配體的表達平衡將會決定某些細胞是否成為NK細胞介導的殺傷靶細胞〔23〕。大部分激活性NK細胞受體也在CD8+T細胞表面表達，通過特異性抗原使TCR受體激活的閾值降低。因此，異常的NK細胞和T細胞受體配體增減可能誘導NK細胞或T細胞介導自身免疫反應。MICA/B是應激性誘導蛋白通過激活性受體NKG2D激活NK細胞和CD8+T細胞〔24〕。NKG2D表達在所有的人NK細胞、δγT細胞、CD8+T細胞表面，潛在的靶細胞表面的配體與NKG2D結合可能打破免疫耐受，如果通過炎癥過程誘導MIC分子非特異性表達或者易感體質個體異常表達，可引發或加重自身免疫性反應的發生。

自身反應性是免疫介導的自身組織或者細胞破壞，這個過程直到抗原消除瞬間消失或者持續存在。這些可能是通過T細胞直接的破壞作用或者是細胞因子介導的對宿主組織的細胞毒性破壞作用。NKG2D及配體在腫瘤和感染行疾病中對有免疫監視作用，但是在自身免疫性疾病疾病中可能是有害的，在腫瘤MICA與NKG2D結合發揮細胞毒效應殺死腫瘤細胞發揮免疫監視作用，在應激情況下，腸上皮組織高表達MIC分子，MIC分子通過NKG2D激活NK細胞或者CD8+T細胞，使對自身組織產生殺傷機制。在自身免疫性疾病中MICA分子作為自身抗原與表達有NKG2D受體的免疫細胞結合發揮細胞毒作用殺傷感染或應激性細胞，對自身組織產生破壞性作用，導致局部黏膜組織炎癥的發生。

NKG2D和配體自身免疫性疾病發病過程中的作用首次在類風濕關節炎的發病過程中發現〔25〕，類風濕關節炎的嚴重程度與外周血和關節炎炎性組織中大量的CD4+CD28－T細胞相關，并發現這些CD4+T細胞都表達NKG2D受體，而在正常的CD4+T細胞表面表達缺失。TNF和IL-15誘導NKG2D的表達，TNF和IL-15在炎性關節滑液和RA患者的血清中大量存在。再者，RA患者異常性的高表達MIC配體，MIC配體能夠刺激自身固有的CD4+CD28－T增殖和分泌INFγ，RA患者的血清中的可溶性MICA含量增加，而這些可溶性MICA是關節滑液來源的，sMICA沒能下調NKG2D的表達，反而表達增加，這主要是腫瘤壞死因子(TNF)和白介素-15(IL-15)的相反的調節作用增強NKG2D的表達。NKG2D的調節異常和組織中MIC的異常表達能夠引起T細胞的激活，NKG2D的特異性表達和MIC分子的異常表達在靶器官組織中的環境中能夠引起自身反應性T細胞的激活，因此引起自身持久的病理反應〔26〕。最近研究表明，在細胞特異性特點上NKG2D信號與IL-15受體機制是一致的〔27，28〕。研究發現人MICA基因多態性與胰島素依賴型糖尿病相關，但是這種多態性的功能相關性仍然不明確，但是很多對非肥胖型糖尿病小鼠(NOD)模型研究，NKG2D與配體參與自身免疫性糖尿病的發病過程〔29〕，NOD小鼠表達NKG2D配體，并且浸潤在胰腺中的自身反應性CD8+T細胞表達有NKG2D受體，抗NKG2D抗體治療抑制自身反應性CD8+T細胞的功能，前驅期糖尿病能夠完全阻止糖尿病的進展。

傳統上認為NKG2D是一種TCR的共刺激分子不能獨立地顯示其功能，最近的研究表明乳糜瀉的研究表明IL-15和IL-2誘導CD8+T細胞表達NKG2D分子，能夠通過NKG2D分子獨立發揮細胞毒性功能。在CD的研究中，高劑量IL-2刺激的CD4+NKG2D+T細胞在無TCR信號介導的情況下能夠單獨發揮細胞毒性作用，IL-15能都上調CD病人的CD4+NKG2D+T細胞NKG2D受體的表達〔30，31〕。最近研究表明IL-15和TNF-α誘導CD4+T細胞表面表達 NKG2D受體，IL-15能夠誘導CD4+T和CD8+T細胞增殖，CD4+T細胞在增長的同時能夠顯著表達NKG2D受體。MICA在腸道上皮細胞高表達，這些CD4+NKG2D+T細胞毒性T細胞能誘導腸道黏膜的破壞。最近研究表明IL-12和IL-15能夠誘導T細胞表面NKG2D的表達而增加細胞的細胞毒性〔32〕。

已經證明乳糜瀉病人腸道上皮中高表達MIC分子與NKG2D分子激活對疾病的發展有關。MIC蛋白在細胞內表達，在在活動性CD病人腸道上皮高表達，并且隨著疾病的痊愈而降低。乳糜瀉病人中腸上皮細胞中IL-15高表達，在NKG2D介導的應激的上皮細胞中產生的IL-15一是能夠誘導MIC分子，二是通過識別腸道上皮細胞的MIC分子，改變腸上皮淋巴細胞的抗原特異性T細胞轉變成為TCR受體特異性的細胞毒性功能〔33～35〕。Ito等〔36〕研究發現調節 NKG2D 信號通路能夠控制實驗性大鼠慢性結腸炎癥。Kjellev等〔37〕通過實驗性大鼠研究發現CD4(+)NKG2D(+)T細胞在實驗性結腸炎老鼠體內增加，NKG2D在這種實驗模型中早期炎癥的發生發展中起著重要作用，Perera等〔38〕研究非經典MHCⅠ類分子在IBD腸道上皮細胞的表達情況，諸多證據表明IBD的腸黏膜免疫反應失調，其中涉及炎性細胞的異常激活和(或)特異性調節性T細胞的激活失敗。Lü等〔39〕體外研究發現UC患者中腸黏膜MICA mRNA表達升高，MICA*A5.1基因型UC患者表達于腸黏膜上皮細胞的MICA*A5.1蛋白易脫落，形成可溶性MICA分子，導致腸黏膜上皮細胞表達下降，從而減弱NK細胞，γδT細胞和CD8+T細胞等對其的識別和清除，擾亂正常的免疫監視和免疫調節等。同時sMICA分子可能在腸黏膜局部持續性刺激腸黏膜內淋巴細胞和其他免疫調節性細胞等，從而使局部的免疫反應亢進，導致 UC的發生。Park等〔40〕研究轉基因(T3b-MICA Tg)老鼠，選擇性地在小腸表達MICA分子，結果顯示在腸道上皮細胞有TCRαβ CD4 CD8αα雙陽性黏膜上皮淋巴細胞。Allez等〔41〕研究顯示CD和UC患者腸上皮MICA表達上調，MICA可能與腸上皮細胞和腸黏膜T細胞表達的NKG2D受體結合，殺傷表達MICA的靶細胞，CD4+NKG2D+細胞毒性T細胞導致炎癥的發生以致腸道黏膜的損傷，比CD患者的低。在UC、CD和正常對照組中外周血和腸黏膜CD8+T細胞表面NKG2D的表達沒有差別;但是在CD外周血和腸黏膜患者中CD4+NKG2D+T細胞較UC和正常組的高，提示NKG2D-MICA介導的細胞毒效應對腸黏膜產生損傷作用，并作為效應性T細胞產生高水平的IFN-γ，CD4+NKG2D+T細胞能夠殺傷外源性表達MICA分子靶目標，但是UC無這種效應。MICA基因是如何影響UC的起病及發病過程，國內外在這方面的報道也很少。

2 巨細胞病毒感染與UC的相關性

人巨細胞病毒(HCMV)屬于皰疹病毒家族，它能在人體內建立起一個終身持久的潛伏性感染，并且間歇不斷復發，當人免疫力強盛時潛伏而不顯，但是在人體免疫力低下時，可出現復發感染，造成嚴重損傷，在西方人群中感染率為70% ～80%〔42〕。雖然病毒感染大多處于潛伏狀態，但增加了免疫力缺乏的個體包括手術移植的宿主個體的發病率和死亡率。體外研究表明，HCMV能夠誘導大量MHC-Ⅰ類分子MICA和MICB的表達，這些蛋白都是NKG2D受體的配體，NKG2D受體表達在NK細胞，CD8+T細胞，γδT細胞表面，MICA是細胞毒作用、細胞增殖、細胞因子分泌的共刺激分子，MICA蛋白表達在腸道上皮細胞和血管上皮細胞表面，成纖維細胞，但是不在外周血T和B細胞表面表達〔43，44〕，是一種應激性蛋白，在熱休克，射線，或者感染的情況下或者某些腫瘤細胞表面表達。HCMV編碼的蛋白結合細胞的MICB、ULBP1和ULBP2阻止了這些蛋白表達于細胞表面，這樣阻止了這些蛋白結合激活性受體NKG2D產生NK細胞激活信號，但是MICA不與UL16蛋白結合〔45〕，還是表達于細胞表面，說明MICA在巨細胞病毒感染后發揮著重要作用，但MICA在HCMV感染中的機制尚未明確。

HCMV感染與IBD等慢性疾病之間的相關性研究日益增多〔46，47〕，HCMV侵入機體后常呈無癥狀性感染，可能是機體免疫功能受抑制時可被激活，但是HCMV的具體發病機制還不明確，需進一步研究。胃腸道巨細胞病毒感染疾病可能在免疫功能正常人群中發生，但是大部分是有免疫缺陷綜合征或者器官移植，癌癥化療后和激素治療病人，在胃腸道巨細胞病毒感染疾病，總的發病率和病理損害的部位根據宿主免疫缺陷的原因產生，潰瘍、邊緣性磨損、黏膜下出血是肉眼可見的病理損害，然而與巨細胞病毒感染有關的腸道病理損害非常復雜并且機制仍然不清楚。最近研究〔48〕報道IBD病人巨細胞病毒感染，IBD病人中特別是UC病人，HCMV復發感染較常見，可能是因為這些病人經常使用免疫抑制劑，復發感染能夠引起嚴重潰瘍，再者HCMV能夠誘導重度UC，甚至一些沒有接受過免疫抑制劑治療的UC病人。然而HCMV在IBD病人腸道炎癥的發病意義至今不明確，有報道〔49〕HCMV在激發炎癥過程中起到關鍵作用，有研究〔50〕報道CMV在腸道中無發病作用。

我國巨細胞病毒感染率比較高并與許多疾病相關，但在IBD中的研究較少。遺傳易感性作為IBD發病的內因基礎已經比較明確，有學者〔51〕研究認為某些病毒的感染也是IBD發病的環境因素之一，可能是遺傳背景的個體在CMV感染后導致了免疫耐受的破壞而引起自身免疫反應而觸發IBD。國外研究顯示在免疫缺陷綜合征患者中MICA*A5.1感染HMCV的危險度增加〔52〕。本課題組前期研究〔53〕表明 MICA*A5.1與UC相關，MICA和MICB在腸道上皮中表達增加，NK細胞MICA的受體NKG2D表達增加，并發現患者血清中可溶性MICA分子較正常人高，UC患者外周血NK細胞表達NKG2D及胞內INF-γ的量均高于正常對照者。這些是否因為腸道病毒感染所致，在我國巨細胞病毒感染是否是UC的發病原因，是否具有MICA*A5.1基因型的患者在病毒感染和基因易感的情況下引起腸道炎癥的發生。

IBD的發病機制與遺傳和環境等多種因素導致的免疫應答異常有關，特別是 CD4+T細胞的機制研究較多，但在NKG2D受體的激活上研究較少。NKG2D受體在NK細胞、δγT細胞、CD8+T細胞以及激活的CD4+T細胞表面都有表達，但是MICA是如何影響腸道炎癥的發生發展的;MICA分子是與哪種炎性細胞相互作用產生細胞毒性作用從而產生對腸道黏膜的損傷破壞作用?NKG2D-MICA介導的炎癥在IBD中的免疫過程中的信號轉導通路又是如何;NKG2D及配體相互作用是直接的細胞毒性作用還是作為共刺激分子激活T細胞發揮細胞毒性作用，發揮作用的信號傳導通路是什么，這些都需要做進一步的研究。

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