半胱胺對帕金森病小鼠模型多巴胺能神經元的影響

孫林娟 徐勝利 周 明 毛麗君 陳 彪 (中國中醫科學院西苑醫院神經內科，北京 0009)

目前帕金森病(PD)的治療以增加腦內多巴胺(DA)濃度的替代治療為主，隨著用藥時間的延長，藥物導致的副作用嚴重影響患者的治療。尋找具有多巴胺能神經保護作用和增加腦內DA濃度的藥物成為研究的熱點。半胱胺是美國食品和藥品管理局(FDA)批準應用于胱氨酸病的藥物，是細胞內正常存在的成分。研究證明，半胱胺具有抑制脂質過氧化、蛋白羰基化作用，提高超氧歧化酶活性、谷胱甘肽和過氧化氫酶的活性，促進細胞巰基儲存和自由基清除〔1〕。半胱胺在亨廷頓病(HD)動物模型中具有保護DA能神經元的作用，已經應用于HD臨床研究〔2〕。但半胱胺在PD中的研究未見報道，并且半胱胺的神經保護作用劑量報道不一。本研究旨在探討半胱胺在PD動物模型中的效果，為半胱胺在PD中的應用提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器 DA、MPTP、酪氨酸羥化酶(TH)單克隆抗體均購自Sigma-Aldrich;HClO4及配制流動相所用試劑均為色譜級。

1.2 實驗動物準備 取78只SPF級6～8周齡C57BL小鼠(由軍事醫學科學實驗動物中心提供)，體重20～23 g。每籠5只，自由攝食、飲水;照明:黑暗時間為12 h:12 h。所有實驗程序均按照實驗動物指南(美國國立衛生研究院的出版物第80-23號，1996年修訂);我們使用能獲得有效實驗數據的最少動物，盡量減輕動物的痛苦。給予小鼠腹腔注射0.9%生理鹽水新鮮配制的 MPTP-HCl(20 mg/kg)，共5 d，首先2次/d×2 d，間隔12 h，繼之1次/d×3 d。分組為:(1)對照組;(2)MPTP模型組;半胱胺預防組:(3)半胱胺20 mg/kg+MPTP組、(4)半胱胺75 mg/kg+MPTP組;半胱胺治療組:(5)MPTP+半胱胺20 mg/kg組、(6)MPTP+半胱胺75 mg/kg組。半胱胺預防性給藥分2個劑量組(半胱胺20 mg/kg，75 mg/kg)，半胱胺2次/d×4 d，第5天起同時給以MPTP;半胱胺治療性用藥與MPTP同天給藥;總療程14 d。

1.3 紋狀體樣品制備 末次藥物注射后24 h，動物斷頭處死后，立即分離紋狀體，自皮質前端與大腦中線交點向后1.7～3.5 mm區域與中線旁0.8～3.3 mm區域為雙側紋狀體〔3〕，剝離皮層，將組織放入已經編號的一次性加蓋塑料管中，投入液氮中保存。標本收集完畢后，轉入－80℃冰箱保存。稱重量后，每15 mg組織加入1 ml 0.4 mol/L HClO4，冰浴中超聲破碎組織，功率200 W、超聲2 s、間隔2 s，共5次;12 000 r/min 4℃離心12 min;離心2次，取上清待用;沉淀加入1 ml 0.5 mol/L NaOH，存放于－20℃，Lowry法檢測其中的蛋白含量。

1.4 反向高效液相色譜-電化學(HPLC-ECD)檢測器測定紋狀體DA含量 色譜柱為ZORBAX SB-C18柱，4.6 mm×150 mm，粒徑5 μm;流動相(新鮮配制并經0.22 μm的濾膜過濾)為0.035 mol/L無水枸櫞酸;0.09mol/L無水醋酸鈉，0.23 mmol/L辛烷基磺酸鈉(SOS，Sigma公司);0.13 mmol/L乙二胺四乙酸，10%甲醇，pH4.7，流量1.0 ml/min，檢測器工作電位0.50 V，靈敏度5 nA。配置不同濃度的DA標準品，標準品的質量濃度2～1 000 μg/L，做標準曲線，標準品與待測樣品以20 μl進樣，根據色譜峰面積進行定量。

1.5 免疫組織化學檢測 末次注射半胱胺后24 h，用水合氯醛(100 mg/kg)深度麻醉小鼠后迅速開胸暴露心臟，剪開右心耳，經左心室快速灌注冰生理鹽水50 ml和4%多聚甲醛100 ml。斷頭取出全腦，在上述固定液中后固定24 h，再依次放入30%的蔗糖溶液中，待腦組織下沉后修整中腦組織塊，在冰凍切片機上進行冠狀連續冰凍切片，片厚30 μm。切片放入0.01 mol/L PBS中進行漂片處理。切片的染色過程嚴格按ABC試劑盒說明書操作，過程包括:PBS漂洗5次，0.3%Triton-PBS 30 min，3%H2O230 min，PBS 漂洗 3 次，5%羊血清封閉30 min，在含1%胎牛血清、0.3%Triton的PBS液中加入兔抗酪氨酸羥化酶一抗(1∶10 000)，4℃冰箱中過夜;PBS漂洗3次，加入生物素標記的羊抗兔IgG二抗(1∶500)孵育2 h，PBS漂洗3次，加入HRP三抗工作液(1∶500);DAB顯色。以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照。TH染色陽性的神經元計數方法:應用裝載NIS-Elements成像軟件的Nikon顯微鏡計數。每張切片雙側計數兩遍，取平均數作為該張切片的陽性細胞數，計數各組的細胞數再取平均數，結果以各組神經元數量占對照組的%表示。

2 結果

2.1 MPTP對小鼠紋狀體DA水平和黑質TH陽性神經元的影響 MPTP組紋狀體DA水平比正常組下降了55%(26.38±6.47 vs 57.62±12.70，P＜0.01)。MPTP導致模型組TH陽性神經元的數目為對照組的56.37%(166.65±38.14 vs 295.65±47.46，P ＜0.01)。

2.2 半胱胺對MPTP模型小鼠紋狀體DA水平的影響 半胱胺(20 mg/kg)預處理4 d再給予MPTP組有效地預防MPTP導致的多巴胺降低(47.96±10.57，P＜0.01);半胱胺(20 mg/kg)治療組、半胱胺(75 mg/kg)預防和治療組的多巴胺含量與MPTP模型組比較均沒有統計學差異(36.27±16.42，25.65±7.71，25.08 ±8.10，P ＞0.05)。

2.3 半胱胺對MPTP模型小鼠黑質TH陽性神經元的影響半胱胺(20 mg/kg)預處理4 d再給予MPTP組有效地預防MPTP導致的TH陽性神經元的數目降低(267.45±34.01，P＜0.01)。半胱胺(20 mg/kg)治療組、半胱胺(75 mg/kg)預防和治療組的TH陽性神經元與MPTP模型組比較無統計學差異(179.55 ±38.11，172.10 ±32.68，174.05 ±35.77，P ＞0.05)。

3 討論

PD臨床癥狀的產生是由于黑質DA能神經元的退變和DA含量的減少。既有神經保護作用同時又能提高神經遞質多巴胺水平的藥物是治療PD理想和有效的藥物。本實驗結果顯示，我們證明半胱胺在20 mg/kg低劑量時可以保護MPTP導致的C57小鼠黑質TH陽性神經元和紋狀體DA的丟失，與Tremblay等〔4〕報道的結果一致。

早期關于半胱胺的報道是給以C57小鼠半胱胺治療后，半胱胺導致了劑量依賴性的紋狀體DA濃度的增高。我們的實驗顯示僅僅在低劑量(20 mg/kg)時產生了保護作用，相對高劑量(75 mg/kg)沒有顯示神經保護作用。結果的不同也許來自于不同的給藥方法和不同的給藥頻率和時間。在Oishi等〔5〕的研究中，半胱胺給以的劑量明顯高于本次實驗，但是半胱胺是在MPTP給藥前30 min單次給予200 mg/kg。而在本次實驗中我們給以小鼠半胱胺治療14 d，明顯長于以前的實驗，半胱胺的總劑量在低和高劑量組分別達到了280 mg/kg和1 050 mg/kg，兩者都高于以前的報道。因此，由高劑量的半胱胺導致的毒性作用也許反映了半胱胺的累積效應，半胱胺劑量效應對于神經功能的毒性作用也在HD小鼠模型中報道，在半胱胺的劑量達到600 mg/kg時產生了明顯的認知功能的損害。Vecsei等〔6〕報道，在給予半胱胺后在不同腦區幾乎都導致了去甲腎上腺素的丟失，但是DA的變化是選擇性和雙向性的。CS在低劑量時具有神經保護，而在高劑量則有毒性作用，表明了神經保護劑的雙向作用效應〔7〕。盡管超劑量怎樣導致神經毒性還是不清楚，這觀察到的毒性仍然值得我們注意，在以后的實驗和臨床試驗研究中半胱胺的劑量和給藥時間都應該是被考慮的因素。綜上所述，半胱胺可以保護由MPTP誘導的PD小鼠模型的DA能神經元的毒性，并且保護作用與給藥的劑量和時間密切相關。在臨床其他疾病中的有效性和安全性將使半胱胺在以后治療包括PD在內的神經退行性變疾病中成為有效的治療策略。

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3 Chan E，Kovacevic N，Ho SK，et al.Development of a high resolution three-dimensional surgical atlas of the murine head for strains 129S1/Svimj and C57Bl/6J using magnetic resonance imaging and micro-computed tomography〔J〕.Neuroscience，2007;144(2):604-15.

4 Tremblay ME，Saint-Pierre M，Bourhis E，et al.Neuroprotective effects of cystamine in aged parkinsonian mice〔J〕.Neurobiol Aging，2006;27(6):862-70.

5 Oishi T，Hasegawa E，Murai Y.Sulfhydryl drugs reduce neurotoxicity of 1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine(MPTP)in the mouse〔J〕.J Neural Transm Park Dis Dement Sect，1993;6(1):45-52.

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