KATP通道基因多態性與2型糖尿病及磺脲類藥物療效的相關性

邵 倩 班 博 施錦繡 張 梅 孫海玲 (山東大學研究生院，山東 濟南 500)

2型糖尿病(T2DM)是一種由遺傳因素和環境因素共同作用的代謝性疾病，以胰島素分泌及(或)作用受損為特征。研究發現ATP敏感性鉀(KATP)通道在胰島素分泌中起著重要作用〔1〕，胰島β細胞膜上KATP通道是由磺脲類受體1(SUR1)及鉀離子內向整流(Kir6.2)通道兩種亞單位組成的八聚體，是胰島素分泌的物質基礎，通過將細胞膜電活動與細胞代謝聯系起來，調控胰島素的分泌。此外，KATP通道還是磺脲類藥物作用的靶點〔2〕。SUR1由ABCC8基因編碼，Kir6.2由 KCNJ11基因編碼，目前ABCC8和KCNJ11基因已在包括亞洲人群在內的多個種族進行了廣泛研究，并且證明和T2DM有關〔3，4〕，但是尚不清楚這種相關性是否也影響磺脲類藥物療效。本研究主要探討在山東漢族人群中ABCC8、KCNJ11基因多態性與T2DM的相關性，并觀察與磺脲類藥物療效的相關性。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2010年10月至2012年7月山東地區漢族人共300例為研究對象，其中T2DM患者(T2DM組)200例(男105例，女95例);正常對照組(NC組)100例(男53例，女47例)，為與病人無血緣關系的血糖正常者。T2DM的診斷依據1999年WHO標準;T2DM患者病例排除標準:①糖尿病急性應激狀態如急性心肌梗死、腦卒中、糖尿病酮癥酸中毒、糖尿病非酮癥高滲性昏迷等;②明顯的肝、腎功能異常者;③近期使用過影響肝、腎功能藥物者。所有對象在知情同意的情況下，簽署知情同意書。以磺脲類藥物是否有效，將200例T2DM患者分為(SFS)組86例(男42例、女44例)，有效組114例(男63例，女51例)。SFS標準:曾經有至少3個月初始使用磺脲類(或聯合二甲雙胍)的有效期，在適當飲食、運動基礎上，磺脲類加至每日最大劑量〔如格列苯脲(優降糖)15 mg、格列吡嗪(美吡達)30 mg等〕，失效持續1～3個月，尚未使用INS，空腹血糖＞10.0 mmol/L，糖化血紅蛋白＞9.0%。磺脲類治療有效標準:糖尿病飲食控制加磺脲類(或聯合二甲雙胍)空腹血糖＜9.0 mmol/L，糖化血紅蛋白＜8.4%。兩組胰島細胞表面抗體(ICA)、胰島素抗體(IAA)和谷氨酸脫羧酶抗體(GAD-Ab)均陰性。

1.2 研究方法

1.2.1 一般資料采集 收集所有入選對象的基本資料，包括年齡、性別、糖尿病病程、測量身高、體重，計算體質量指數=體質量/身高2(kg/m2)。采用全自動生化分析儀測定各組的血糖、糖化血紅蛋白、血脂等指標，采用化學發光法檢測T2DM組空腹C肽及標準饅頭餐后2 h-C肽水平。

1.2.2 DNA提取 所有受檢者取肘靜脈血2 ml，用EDTA-K2抗凝，采用鹽析法抽提基因組DNA(QIAGEN)，應用NanoDrop-1000(USA)檢測其濃度和純度后，稀釋至30 ng/μl。

1.2.3 SNaPshot技術檢測 (1)多重PCR擴增:PCR反應體系為 10 μl，含基因組 DNA 1 μl(30 mg/L)，0.3 μl的 dNTP(10 mmol/L)，1 μl 10 × PCR 緩沖 液，0.52 μl MgCl2溶 液(25 mmol/L)，0.1 μl HotStar(Sigma 公司)，6.68 μl無核酸酶的去離子水，各引物對的終濃度為0.1 μmol/L。多重PCR反應條件:95℃預變性15 min，94℃變性40 s，63℃退火1 min，每個循環下降0.5℃，72℃延伸1.5 min，15個循環;94℃變性40 s，56℃退火 40 s，72℃延伸 1.5 min，25 個循環;72℃8 min，4℃保存，PCR反應在9700熱循環儀(ABI公司)中進行。(2)擴增產物的純化:取1.0 μl擴增產物，加入2.0 U蝦堿性磷酸酶(SAP 酶，USB，U.S.A)，2.0 U Exo I酶(Epicentre Biotechnologies，USA)，去離子水 2.6 μl，反應總體系為 6 μl，混勻后 37℃保溫60 min，然后75℃滅活15 min，4℃保存。(3)延伸標記、純化，反應體系為 5 μl，含純化物 2 μl，SNaPshot Multiplex Mix(ABI公司)0.5 μl，去離子水 1.3 μl，每種引物在反應體系中的終濃度分別為0.2 μmol/L。PCR循環條件為:96℃預變性10 s，96℃變性 10 s，50℃(53 C)退火 5 s，60℃ 延伸 30 s，25 個循環，PCR反應在9700熱循環儀(ABI公司)中進行。反應結束后進行第2次純化，每反應產物中加入1 U SAP酶，37℃保溫60 min，75℃滅活15 min，4℃保存。(4)每反應體系中加入Hi-Di甲酰胺(ABI 公司)9.25 μl，內標 LIZ-120(ABI 公司)0.1 μl，第 2 次純化產物 1 μl，混勻離心后，95℃ 變性 5 min，迅速冰冷4 min。于ABI公司3730遺傳分析儀進行毛細管電泳，應用GeneMaperV4.0軟件進行數據分析。在所有樣本中，每一個SNP的基因分型成功率＞98%。在隨機抽取的樣本中所有的重復分型的一致率均為100%。

1.3 統計學分析 以Hardy-Weinberg平衡法檢驗研究樣本的群體代表性，計數資料采用χ2檢驗。正態分布計量資料以s表示，偏態分布變量以中位數(25%位數，75%位數)表示，組間計量資料均數比較采用t檢驗，偏態變量在統計學處理前先經自然對數轉換。多因素分析用Logistic回歸分析，計算比值比(odds ratio，OR)及其95%置信區間(95%CI)。上述數據處理運用SPSS13.0統計軟件。

2 結果

2.1 ABCC8基因rs1799854、KCNJ11基因rs5219基因型和等位基因分布 ABCC8基因rs1799854、KCNJ11基因rs5219分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律。ABCC8基因rs1799854位點基因型頻率分布在NC組和T2DM組差異有統計學意義(P＜0.05)，且“t”等位基因在T2DM組顯著高于NC組(P＜0.05，OR=1.59，95%CI=1.13 ～2.24)。KCNJ11 基因 rs5219基因型頻率分布在NC組及T2DM組差異無統計學意義(P＞0.05)。見表1。

2.2 NC組與T2DM組的臨床資料比較 與NC組比較，T2DM組年齡、TG均明顯高于NC組(P＜0.01)，HDL-C明顯低于NC組(P＜0.01)。見表2。

表1 ABCC8基因rs1799854、KCNJ11基因rs5219基因型和等位基因分布〔n(%)〕

表2 T2DM組與NC組臨床資料比較(s)

表2 T2DM組與NC組臨床資料比較(s)

與NC組比較:1)P＜0.01

項目 NC組(n=100)T2DM組(n=200)53/47 105/95年齡(歲)51.69±7.85 56.46±9.051)BMI(kg/m2)25.43±3.33 25.20±2.91 TG(mmol/L)1.56±1.59 2.09±0.771)TC(mmol/L)5.08±0.97 4.90±1.01 HDL-C(mmol/L)1.63±1.39 1.23±0.221)LDL-C(mmol/L)男/女(n)2.89±0.87 2.81±0.72

2.3 ABCC8基因rs1799854、KCNJ11基因rs5219在磺脲類藥物繼發失效組及有效組基因型和等位基因分布 觀察了200例應用磺脲類降糖藥物患者，按其療效分組，可見失效組和有效組間，ABCC8基因rs1799854基因型頻率分布差異有統計學意義(P＜0.05)，且“t”等位基因在失效組明顯高于有效組(P＜0.05，OR=1.87，95%CI=1.23～2.85);KCNJ11基因 rs5219基因型頻率分布在失效組及有效組差異無統計學意義(P＞0.05)。見表3。

表3 ABCC8基因rs1799854、KCNJ11基因rs5219基因型和等位基因分布〔n(%)〕

2.4 ABCC8基因rs1799854在T2DM組不同基因型間臨床資料比較 ABCC8基因rs1799854 t/t基因型SFS發生率、FPG、HbA1c、2 h PG顯著高于 c/t+c/c型組(P﹤0.01)，而 BMI、2 h-C肽顯著低于c/t+t/t組(P﹤0.01)。見表4。

表4 ABCC8基因外顯子rs1799854不同基因型間臨床資料比較(s)

表4 ABCC8基因外顯子rs1799854不同基因型間臨床資料比較(s)

與c/c+c/t組比較:1)P＜0.01

項目 c/c+c/t(n=121)t/t(n=79)64/57 41/38年齡(歲)57.05±9.89 55.66±7.55 BMI(kg/m2)25.72±2.99 24.41±2.591)病程(歲)6.00(2.00，10.00)7.00(3.00，14.00)SFS〔n(%)〕 40(33.1)46(58.2)1)HbA1c(%)8.84±1.43 9.70±2.081)FPG(mmol/L)9.24±2.42 10.54±3.741)2 h PG(mmol/L)17.79±3.67 19.33±3.811)F-C肽(mmol/L)2.11±0.67 1.99±0.69 2 h-C肽(mmol/L)7.20±2.56 6.09±2.241)男/女(n)

3 討論

ABCC8基因是ATP結合盒(ABC)C亞單位8號成員，編碼磺脲類受體1(SUR1)，KCNJ11基因是內向整流鉀通道蛋白J亞單位11號成員，編碼內向整流鉀通道(Kir6.2)蛋白，二者均位于染色體11p15.1上，相距4.5 kb，4個SUR1亞單位圍繞4個Kir6.2亞單位共同組成KATP通道，該通道在調節胰島素的分泌中起著重要作用，其調控過程呈血糖依賴性，當血糖波動時，細胞內ATP/ADP比例改變，通過ABCC8基因及KCNJ11基因調節KATP通道的開關，進而影響胰島素的釋放〔5〕。

研究表明，ABCC8基因和KCNJ11基因與T2DM相關，ABCC8基因和KCNJ11基因的變異均可引起新生兒糖尿病及家族性持續性高胰島素低血糖癥〔6，7〕。目前文獻報道，ABCC8基因某些位點的多態性與T2DM存在相關性，但在不同的人種結果往往存在差異性。在本研究中，rs1799854基因型分布在T2DM組與NC組差異有統計學意義(P＜0.05)，這與日本、土耳其、北歐白種人、中國北方人群的研究結果一致〔3，8～10〕，而與高加索人、中國南方人群的研究結果不一致〔11，12〕。KCNJ11 基因rs5219是在高加索人及亞洲人中研究最多的位點，研究證明在高加索人中rs5219與T2DM相關〔13～15〕，而在亞洲人的研究報道中結果不一。本研究發現山東漢族人群中rs5219在T2DM組與NC組基因型分布差異無統計學意義(P＞0.05)，這與日本、丹麥、中國安徽、青島地區人群的報道相同〔3，16～18〕，而與中國南方人群的研究不同〔12〕。ABCC8及KCNJ 11基因多態性的分布由于環境、遺傳背景不同可能在不同種族間存在差異，那么，如何解釋中國人的基因分布在南北方人群中結果的差異呢?最近中國人類起源的遺傳學研究發現中國人類起源于非洲，從南方進入中國，然后遷徙至北方〔19〕，在遷徙過程中可能以自然條件分割，形成了不同的隔離人群，如中國的黃河、長江等，不同的隔離人群其遺傳物質可能是有差異的。

本研究顯示，T2DM組年齡、TG顯著高于NC組，而HDL-C顯著低于NC組，在進行非條件多因素Logistic分析時，發現rs1799854 t/t基因型、年齡是 T2DM發生的獨立危險因素，HDL-C與T2DM的發生呈負相關關系。這提示T2DM的發生擁有復雜的機制，可能是遺傳因素與環境因素共同作用的結果。因此，對于年齡較大的人群更應該合理膳食，注意維持提質量、血脂等的正常，以減少危險因素的聚集。

磺脲類藥物作為一種胰島素促泌劑，通過與胰島β細胞膜上的磺脲類受體結合，關閉細胞膜上ATP敏感性鉀離子通道，使鉀離子外流減少，細胞膜去極化，導致電壓門控性鈣通道開放，鈣離子內流，促進胰島素的釋放。本研究發現ABCC8基因rs1799854多態性與SFS發生相關，且t等位基因分布頻率在SFS組明顯高于有效組，這與袁莉等〔20〕的報道一致。比較T2DM組rs1799854不同基因型，SFS發生率在t/t型組顯著高于c/t+c/c型組，且t/t型組2h-c肽顯著低于c/t+t/t型組，這與紀立農等〔21〕的研究報道一致。與此同時，HbA1c水平在t/t型組顯著高于c/t+t/t型組，而在Nikolac等〔22〕的報道中，也發現在應用磺脲類藥物治療的T2DM患者，t/t型組HbA1c顯著高于其他基因型組。

ABCC8基因rs1799854與SFS的關系少有報道，且具體機制尚不清楚，推測可能機制:(1)由于該突變位于外顯子16剪切部位上游，在轉錄過程中，影響了正常的剪接，使SUR1功能受到影響，進而影響KATP通道，導致胰島素釋放障礙。(2)也可能與ABCC8基因上發生變異的其他功能性位點存在強烈的連鎖不平衡〔3〕，影響胰島素的分泌功能而導致SFS。(3)由于t/t型血糖控制較差，高糖毒性可能又反過來加重了胰島分泌功能障礙，進一步影響藥物療效。

綜上所述，ABCC8基因rs1799854可能是山東漢族T2DM人群的易感基因，并可能通過改變KATP通道功能而影響磺脲類藥物療效。由于T2DM的高度異質性及降糖療效的顯著差異，這一研究結果還需要在不同地域、不同種族的人群中進行大樣本的重復來驗證。

1 Bryan J，Munoz A，Zhang X，et al.ABCC8 and ABCC9:ABC transporters that regulate K+channels〔J〕.Pflugers Arch，2007;453(5):703-18.

2 Bryan J，Crane A，Vila-Carriles WH，et al.Insulin secretagogues，sulfonylurea receptors and K(ATP)channels〔J〕.Curr Pharm Des，2005;11(21):2699-716.

3 Yokoi N，Kanamori M，Horikawa Y，et al.Association studies of variants in the genes involved in pancreatic beta-cell function in type 2 diabetes in Japanese subjects〔J〕.Diabetes，2006;55(8):2379-86.

4 Doi Y，Kubo M，Ninomiya T，et al.Impact of Kir6.2 E23K polymorphism on the development of type 2 diabetes in a general Japanese population:The Hisayama Study〔J〕.Diabetes，2007;56(11):2829-33.

5 Seino S，Miki T.Physiological and pathophysiological roles of ATP-sensitive K+channels〔J〕.Prog Biophys Mol Biol，2003;81(2):133-76.

6 Smith AJ，Taneja TK，Mankouri J，et al.Molecular cell biology of KATPchannels:implications for neonatal diabetes〔J〕.Expert Rev Mol Med，2007;9(21):1-17.

7 Nichols CG，Koster JC，Remedi MS.Beta-cell hyperexcitability:from hyperinsulinism to diabetes〔J〕.Diabetes Obes Metab，2007;9(Suppl 2):81-8.

8 Meirhaeghe A，Helbecque N，Cottel D，et al.Impact of sulfonylurea receptor 1 genetic variability on non-insulin-dependent diabetes mellitus prevalence and treatment:a population study〔J〕.Am J Med Genet，2001;101(1):4-8.

9 Gonen MS，Arikoglu H，Erkoc KD，et al.Effects of single nucleotide polymorphisms in K(ATP)channel genes on type 2 diabetes in a Turkish population〔J〕.Arch Med Res，2012;43(4):317-23.

10 紀立農，韓學堯，王 虹，等.磺脲類藥物受體基因多態性與非胰島素依賴型糖尿病的相關性〔J〕.中華醫學雜志，1998;78(10):774-5.

11 van Dam RM，Hoebee B，Seidell JC，et al.Common variants in the ATP-sensitive K+channel genes KCNJ11(Kir6.2)and ABCC8(SUR1)in relation to glucose intolerance:population-based studies and meta-analyses〔J〕.Diabet Med，2005;22(5):590-8.

12 Zhou DZ，Zhang D，Liu Y，et al.The E23K variation in the KCNJ11 gene is associated with type 2 diabetes in Chinese and East Asian population〔J〕.J Hum Genet，2009;54(7):433-5.

13 Gloyn AL，Weedon MN，Owen KR，et al.Large-scale association studies of variants in genes encoding the pancreatic beta-cell KATPchannel subunits Kir6.2(KCNJ11)and SUR1(ABCC8)confirm that KCNJ11 E23K variant is associated with type 2 diabetes〔J〕.Diabetes，2003;52(2):568-72.

14 Florez JC，Burtt N，de Bakker PIW，et al.Haplotype structure and genotype-phenotype correlations of the sulfonylurea receptor and the islet ATP-sensitive potassium channel gene region〔J〕.Diabetes，2004;53(5):1360-8.

15 Chistiakov DA，Potapov VA，Khodirev DC，et al.Genetic variations in the pancreatic ATP-sensitive potassium channel，beta-cell dysfunction，and susceptibility to type 2 diabetes〔J〕.Acta Diabetol，2009;46(1):43-9.

16 Hansen L，Echwald SM，Hansen T，et al.Amino acid polymorphisms in the ATP-regulatable inward rectifier Kir6.2 and their relationships to glucose and tolbutamide-induced insulin secretion，the insulin sensitivity index，and NIDDM〔J〕.Diabetes，1997;46(3):508-12.

17 張險峰，楊明功，王長江，等.Kir6.2基因多態性與2型糖尿病的相關研究〔J〕.中華醫學遺傳學雜志，2001;18(6):486-7.

18 王桂鳳，姜文潔，姜秀波，等.KCNJ11基因E23K多態性與2型糖尿病的關聯研究〔J〕.青島大學醫學院學報，2011;47(2):102-4.

19 Ke Y，Su B，Song X，et al.African origin of modern humans in East A-sia:a tale of 12，000 Y chromosomes〔J〕.Science，2001;292(5519):1151-3.

20 袁 莉，鄭 娟，陳璐璐，等.SUR1基因多態性與磺脲類藥物療效的相關性〔J〕.華中科技大學學報(自然科學版)，2004;32(2):89-90.

21 紀立農，羅晏權，韓學堯.磺脲類藥物受體基因多態性與2型糖尿病高危人群血清胰島素水平相關性研究〔J〕.中國糖尿病雜志，2001;9(1):4-7.

22 Nikolac N，Simundic AM，Katalinic D，et al.Metabolic control in type 2 diabetes is associated with sulfonylurea receptor-1(SUR-1)but not with KCNJ11 polymorphisms〔J〕.Arch Med Res，2009;40(5):387-92.