流式細胞術檢測口腔鱗癌CD105與VEGF－C、nm23表達的關系

曹 巖 申葉春 張 凡 常永霞 張 斌 (張家口市第一醫院口腔科，河北 張家口 075000)

實體腫瘤的浸潤生長和轉移均需要血管生成，腫瘤新生血管密度是評估患者轉移及預后的重要指標，而新生血管內皮主要的標記物為CD105。血管內皮生長因子-C(VEGF-C)是目前所知作用最強的血管生長因子，在腫瘤血管形成過程中起重要作用，并與腫瘤淋巴結轉移密切相關;轉移抑制基因nm23是一種腫瘤轉移抑制基因，腫瘤組織該基因的表達降低是實體瘤浸潤生長和轉移的必要條件。VEGF-C和nm23在口腔鱗癌中的表達與微血管密度(MVD)及其口腔鱗癌轉移的關系目前尚不明確。本文探討口腔鱗癌VEGF-C、nm23和內皮細胞CD105表達，與局部血管生成及腫瘤侵襲轉移的關系。

1 材料與方法

1.1 材料 收集河北北方學院附屬第一醫院1992～2006年行手術切除治療的口腔鱗癌患者的存檔蠟塊68例，標本均經病理證實。所有患者術前均未接受放化療及免疫治療，均有完整的臨床病理資料。年齡23～74(平均41.35)歲。有頜下淋巴結轉移者28例，無淋巴結轉移40例。另選擇正常口腔黏膜標本16例作為對照。

1.2 試劑與方法 試劑:兔抗人VEGF-C多克隆抗體、鼠抗人nm23單克隆抗體和鼠抗人CD105單克隆抗體(均為工作液)SP免疫組化超敏染色試劑盒、二氨基聯苯胺(DAB)顯色劑等均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。3氨基-9-乙基-卡唑(AEC)染色劑購自福州邁新生物技術有限公司。采用免疫組織化學SP法，實驗操作按試劑盒說明。VEGF-C和nm23用DAB顯色，用試劑公司提供的陽性片作為陽性對照，用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替第一抗體作為陰性對照。CD105單克隆FITC標記抗體采用美國B-D公司產品。流式細胞術主要步驟:新鮮標本用眼科剪刀粉碎后PBS漂洗，800 r/min離心3 min，2次，70%冷乙醇固定，4℃冰箱過夜，300目尼龍篩網過濾，再用PBS調整細胞濃度至1×106/ml。PBS洗去乙醇，加入FITC標記的熒光抗體，4℃避光孵育30 min，PBS漂洗利用美國B-D公司生產的Facscalibur型流式細胞儀，以波長635 nm、輸出功率為15 W的氬離子激光器作光源檢測分析10 000個細胞。

1.3 結果判定 VEGF-C和nm23均主要為胞質著色，少數為胞核著色，以胞質/胞核內出現棕黃色顆粒的細胞為陽性染色細胞，判定標準為:以陽性細胞率＞25%為陽性表達(+)，陽性細胞率≤25%為陰性表達(－)。CD105陽性率:陽性細胞大于50%為陽性，小于20%為陰性，20% ～50%之間為可疑陽性。

1.4 統計學處理 應用SPSS11.0統計軟件進行χ2、t檢驗和等級相關分析。

2 結果

2.1 VEGF-C和nm23在口腔鱗癌和正常上皮中的表達VEGF-C、nm23在口腔鱗癌組織中的陽性表達率分別為52.94%和48.52%，前者明顯高于正常組織(30.27%)(P＜0.01)，而后者低于正常組織(66.95%)(P＜0.05)。

2.2 VEGF-C和nm23表達與口腔鱗癌淋巴結轉移的關系淋巴結轉移的口腔鱗癌組織中VEGF-C陽性表達率(79.82%)顯著高于無轉移的組織(25.69%)(P＜0.01)，而在有淋巴結轉移的癌組織中nm23的表達(35.88%)明顯低于無轉移的組織(61.03%)(P＜0.05)。

2.3 CD105陽性率 CD105在正常上皮中呈現陰性表達，而在口腔鱗癌中呈現陽性表達(84.17%)，且腫瘤中央陽性率明顯高于腫瘤周邊(P＜0.01)。

2.4 VEGF-C和nm23表達與CD105陽性率的關系 VEGF-C陽性表達的口腔鱗癌CD105陽性率(91.22%)明顯高于其陰性表達組(77.29%)(P＜0.05)，且兩者之間存在密切相關(r=0.863 7，P＜0.01)，nm23陽、陰性表達的口腔鱗癌中CD105陽性率分別為74.17%和86.08%。差異無統計學意義(P＞0.05)，兩者之間不存在直線相關(r=－0.157 7，P＞0.05)。

2.5 VEGF-C和nm23表達的相關性分析 相關分析結果顯示，VEGF-C表達與 nm23表達呈負相關(r=－0.525，P＜0.01)，即VEGF-C陽性表達率較高者nm23陽性表達率較低，VEGF-C陽性表達率較低者nm23陽性表達率則較高。

3 討論

腫瘤的浸潤發展與轉移是惡性腫瘤的臨床生物學特性之一，直接導致口腔鱗癌臨床分期滯后，甚至喪失手術機會，是影響口腔鱗癌預后的主要因素之一。近年來研究表明，腫瘤誘導的血管生成反應與腫瘤的生長、浸潤及轉移密切相關。

VEGF-C為目前已知的作用最強的促血管生成因子，在腫瘤血管形成中起重要作用。VEGF-C是VEGF家族的新成員，它是一種針對淋巴管內皮細胞的有絲分裂原，雙重轉基因小鼠實驗證明，VEGF-C能誘導淋巴管生成，并介導腫瘤細胞播散和區域淋巴結轉移〔1～3〕。VEGF-C和受體VEGF-R3結合后，通過MEK/ERK和PI3激酶/Akt途徑引起淋巴管內皮增生，并可能改變原有的和新生的淋巴管內皮的通透性以及腫瘤細胞和胞外基質的黏附性;同時淋巴管數目增多，使瘤細胞接觸淋巴管的機會增多，也促進腫瘤的轉移。近年來發現VEGF-C及VEGF-R3與頭頸部腫瘤、胃癌、大腸癌、前列腺癌等惡性腫瘤的淋巴管侵犯及淋巴結轉移有關，并且是獨立的預后不良因素。本研究結果提示VEGF-C可能參與口腔鱗癌的發生過程。VEGF-C陽性表達率較高的口腔鱗癌組織有較強的侵襲和穿越淋巴管的能力，其陽性表達可能與口腔鱗癌淋巴結轉移和進展有關。

CD105基因位于人染色體9q34，其蛋白是一種同型二聚體的膜結合糖蛋白，分子量為180 kD，是轉化生長因子受體復合物的成分之一，其功能是參與血管生成。CD105是一種內皮細胞標志物，僅在處于增殖狀態的腫瘤組織血管內皮細胞上而在正常的組織血管上無表達〔4～6〕。本實驗提示VEGF-C在促進口腔鱗癌微血管形成中起一定作用;同時，腫瘤中央部位微血管密度較高，而中央部位由于缺氧導致的壞死也比較嚴重，可能是刺激VEGF-C合成的主要因素，當腫瘤生長到一定體積時，因宿主血管生成不足，而引起局部缺氧，從而刺激腫瘤細胞分泌VEGF-C，促進新生血管生成，增加血管通透性。因此，VEGF-C一方面加速了腫瘤的生長，另一方面促進了腫瘤的轉移。

已知人類的nm23基因家族有8個成員，nm23基因編碼產物是核苷二磷酸激酶，它通過調節GTP的合成參與G蛋白調控的跨膜信息傳遞，從而對細胞的分化及癌基因的轉化起作用，此外研究顯示尚有激發管蛋白聚合的作用，因此具有抑制腫瘤轉移的能力，與抑制腫瘤轉移相關的是 nm23-H1〔7～9〕。nm23-H1編碼一個相對分子質量為18×103的二磷酸核苷激酶，與腫瘤的遠程轉移有關，其抑制腫瘤轉移的作用機制仍不清楚。nm23基因與口腔鱗癌的關系，目前這方面的研究較少，且得出的結果有很大的不一致性，有報道〔8〕認為nm23基因只與宮頸腺癌的預后有關而與宮頸鱗癌無關。有學者〔9〕對乳腺癌、子宮內膜癌、卵巢癌的研究中發現，腫瘤組織中nm23表達與淋巴結轉移或遠處轉移呈負相關，說明nm23基因在腫瘤的浸潤及轉移過程中起重要的抑制作用。本研究提示nm23基因的失活與腫瘤的發展密切相關。nm23基因突變、低表達具有促進腫瘤發展、浸潤和轉移的作用。nm23基因的表達對微血管生成及腫瘤淋巴結轉移可能具有協同作用。本研究提示nm23低表達可能促進VEGF-C高表達，從而促使癌間質血管新生，為腫瘤的浸潤進展提供氧和營養物質;在口腔鱗癌細胞分化、轉移和臨床進展過程中，VEGF-C與nm23之間可能具有相互誘導或信息傳遞的負調節作用。

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