促紅細胞生成素對干細胞作用的研究進展

劉 燕 李法琦 (重慶醫科大學附屬第一醫院老年病科，重慶 400016)

促紅細胞生成素(EPO)是一類唾液酸糖蛋白激素，屬于細胞因子家族，主要由腎臟分泌。Bonsdorff和Jalvisto于1948年首次檢測出血漿中存在的EPO，并將其由Hemopoietine命名為EPO〔1〕。1950～1955年之間，首次確定EPO與紅細胞的生成有關。1977年首次從一個病人的尿中純化出EPO〔2〕。1985年首次克隆出EPO并于1986年開始用于臨床疾病的治療。以往認為EPO與其受體EPOR特異結合刺激骨髓造血，因而在臨床上廣泛用于各種貧血的治療，如:慢性腎衰竭貧血、癌性貧血、艾滋病伴發貧血、遺傳性鐮刀型細胞貧血、遺傳性β-地中海貧血、骨髓異常增生綜合征貧血、自身免疫性貧血和早產兒貧血，及手術用血的輔助治療。近年發現EPOR在全身大多數組織都有分布，自1985年人們應用基因重組技術成功研制出重組人EPO(rhEPO)以來，國內外研究證實rhEPO通過與EPOR結合而發揮促進造血以外的多種生物學作用。

1 EPO及其受體的分子結構及其生物學特性

EPO的分子量約為34 kD，由約165個氨基酸組成，含糖量很高，主要是經唾液酸糖基化。編碼EPO的基因主要位于第7號染色體長臂22區，編碼193個氨基酸組成的蛋白，是有活性EPO的前體，經剪切掉27個氨基酸和唾液酸糖基化及移除末端氨基酸才能發揮其生物學作用。EPO根據糖基化的程度可以分為兩類，一類是α型，含31%的碳水化合物，另一類是β型，含24%的碳水化合物，兩類EPO的基本生理作用和抗原性相似。EPOR分布于全身多個組織，目前發現在紅細胞、內皮細胞、神經細胞、腫瘤細胞、心肌細胞等細胞均有其受體表達〔3〕。EPOR是造血因子家族成員之一，其編碼基因位于19號染色體，分子量約55 kD，由508個氨基酸殘基組成，分為胞外區、跨膜區、胞質區三個部分。EPO及EPO受體的結構決定了它們的生物學功能。EPO促進造血的功能與它的其他功能所需劑量不同，用于造血功能所需劑量較小，而其他功能所需劑量較大。大劑量EPO也能作用于造血系統，可引起紅細胞增多、血黏滯度增高，導致高血壓、血栓形成等并發癥。因此臨床應用的EPO必須經過修飾使其主要與臨床所需保護組織的受體相互作用，而減少并發癥。現臨床作為藥用的EPO是經cDNA克隆翻譯而成的，與天然的EPO有相似的氨基酸序列，并具有更符合臨床應用的藥理學特點。EPOR在不同組織的中的功能區并不一致，但都有信號轉導蛋白的作用。胞漿區含有box1和box2區，是促進細胞有絲分裂和誘導酪氨酸磷酸化的必須結構域，跨膜區是酪氨酸激酶家族的結合區，胞外區含有保守的WSXWS氨基酸序列。JAK2與 EPOR組成 EPOR二聚體〔4〕，EPO與其結合通過發生一系列級聯反應而發揮作用。

2 EPO的產生及調節

EPO在胚胎早期由肝臟合成，以后慢慢轉移至腎，出生以后90%由腎的間質細胞分泌。此外，也有少量EPO由其他組織細胞產生，例如巨噬細胞、星型膠質細胞等〔5〕。作為藥用的EPO早期從尿中提取，目前許多國家已經克隆出EPO基因，并將其cDNA和DNA成功地在猴腎細胞(COS)、中國倉鼠卵巢細胞(CHO)等真核細胞中獲得了高效表達〔6〕。EPO的含量在不同物種的個體內并不是一個穩定的值，會隨著不同的刺激因素而發生變化，研究發現感應低氧基因的表達對EPO基因的表達至關重要〔7，8〕，缺氧誘導核因子通過蛋白合成結合至人EPO基因增強子，從而促進EPO基因的轉錄激活〔9〕。Paliege等〔10〕研究發現與EPO的產生相關的缺氧誘導因子 (HIF)可分為HIF-1α和HIF-2α。他們給予大白鼠脯胺酰羥化酶抑制劑FG-4497處理6 h后，腎分析發現，HIF介導的EPO mRNA表達明顯上調，且HIF-2α在成纖維細胞，內皮細胞，腎小球上皮細胞均有發現，HIF-1α僅在腎小管上皮細胞被發現。調節EPO產生的HIF90%由HIF-2α介導。Paul等〔11〕研究發現將腺苷灌注到游離的小鼠腎中，可誘導EPO的增加。若是在灌注液中加入腺苷拮抗劑或是腺苷脫氨酶，EPO的合成量顯著減少。Nagashima等〔12〕發現腺苷激動劑 5-N-ethylcarboxamideadenosine(NECA)、CHA和KW-3902均能促進鼠的血清EPO水平，并呈劑量依賴性。腺苷A2a的拮抗劑KF17837抑制NECA介導的EPO的產生。Fisher等〔13〕發現即使在常氧條件下培養，腺苷A2a選擇性的激動劑CGS-21580，也能顯著增加Hep3B細胞的EPO mRNA的表達水平。即使將細胞暴露在缺氧條件下，腺苷A2a的選擇性拮抗劑SCH-58261能顯著抑制EPO的表達。Bakris等〔14〕報道茶堿是一類腺苷非選擇性的拮抗劑，能降低紅細胞增多癥患者的血漿EPO水平。Batmunkh等〔15〕報道IL-1通過激活NF-kappaB能抑制HepG2細胞的EPO的產生，給細胞培養液中加入cAMP能抑制NF-kappaB的激活進而增加其EPO的產生。而Gleiter等〔16〕報道腺苷A1受體阻滯劑DPCPX和 KW-3902，腺苷 A1、A2 受體激動劑 CHA、CGS 21680，腺苷再攝取抑制劑EHNA都不能改變暴露在一氧化氮(NO)條件下小鼠血清的EPO的水平。有作者報道前列腺素E1能增加EPO的水平。Gross等〔17〕發現PGE2能增加游離的狗的腎灌注液中的EPO水平。Fink等〔18〕發現β2腎上腺受體激動劑能增加紅細胞增多癥小鼠的EPO水平。Radtke等〔19〕報道在觀察游離的狗的腎臟發現沙丁胺醇能增加EPO及前列腺素的釋放，這與Fink和Fisher的報道一致，并提示沙丁胺醇增加EPO的釋放可能是通過激活β2腎上腺受體。Nelson等〔20〕研究表明PGI2及其代謝產物能顯著增加紅細胞增多癥小鼠血清EPO的水平。Fisher等〔13〕闡述了腺苷和類花生四烯酸增加EPO水平的可能原因。Jelkmann等〔21〕報道在肝細胞培養過程中致裂原下調蛋白激酶C的同工酶，進而EPO水平表達下降。Fandrey等〔22〕在培養HepG2時研究發現白介素-1(IL-1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)能抑制EPO的表達。后也有學者證實了IL-1、脂多糖能抑制EPO的表達。由此看出EPO的表達水平受多種因素的影響，且因素之間相互作用，共同決定實驗對象的EPO的水平。

3 EPO與干細胞

干細胞是一類具有自我更新和多向分化能力的原始未分化細胞，根據干細胞來源的不同可分胚胎干細胞，成體干細胞和羊水干細胞三大類。在機體受損害時，這些干細胞便受多種因素的影響發生增殖、遷移、分化，進而盡可能的恢復機體的功能。國內外研究發現EPO與其他多種因素共同調節各類干細胞的功能，保護組織，使損傷減輕并促進組織功能的恢復。

3.1 EPO與神經干細胞 神經細胞是終末分化細胞，神經的損傷只能由膠質細胞再生修復，嚴重影響了患者的生活質量。因此神經干細胞的移植治療成為了近年來的研究熱點。目前對影響神經干細胞研究較多的因子有:成纖維細胞生長因子，表皮生長因子，膠質細胞神經源性生長因子，睫狀神經營養因子，胰島素樣生長因子-1等。EPO是近年研究較多的又一因素。研究發現，EPOR在成年腦及發育胎腦中均有表達。也有作者發現將EPO注入側腦室，嗅區的神經細胞會增多。Sadamoto等〔23〕用自發性高血壓大鼠制成永久性大腦中動脈梗塞模型，將EPO注射入腦室后，減輕了皮質梗死的程度，并促進丘腦部神經元的細胞的存活。趙舒武等〔24〕研究發現，促紅細胞生成素能促進神經干細胞的增殖和分化，對抗其凋亡。

他們發現EPO用量等于或大于5 U/ml時，神經干細胞的集落明顯多于對照組，將神經干細胞誘導向神經元細胞分化的效率明顯高于對照組，但使用劑量在5，50，500 U/ml之間差別沒有統計學意義。目前研究已經證實EPO對神經干細胞有保護及促分化為神經元的作用，但單一應用誘導效率還是低。羅海龍等〔25〕發現胰島素樣生長因子-1(IGF-1)和EPO誘導大鼠海馬源性神經干細胞向神經元細胞分化有協同作用，使得誘導分化效率更高，但該作用有劑量相關性。他們發現IGF-1和EPO(100 U/ml)的誘導效率最高，而IGF-1與10 U/ml的EPO誘導效率差別沒有統計學意義。腦出血，腦梗死，顱內高壓等顱腦損失疾病均會影響腦細胞的氧供，使細胞缺氧。趙保明等〔26〕研究表明神經干細胞在體外缺氧培養條件下能夠促進其向神經元細胞分化，而EPO與缺氧具有協同作用。但也有研究表明，缺氧有時間的限制，在短時間可以促進神經干細胞增殖，長時間影響其生長。Kang等〔27〕研究發現EPO與胰島素樣生長因子聯合應用能對抗免疫缺陷病毒對大腦的侵犯，改善其引起的神經衰弱，癡呆等癥狀。Cao等〔28〕發現EPO的作用并不總是有益的。他們的研究表明EPO能促進腫瘤的生長，高表達EPOR是神經膠質瘤干細胞得以維持的重要因素。神經膠質瘤干細胞表達的EPOR是非干細胞類的幾倍。如果用阻斷劑阻斷EPO與其受體的相互作用，腫瘤生長明顯減慢，變小。Wang等〔29〕發現EPO也能改變脊髓原神經干細胞的增殖周期，但有趣的是與細胞增殖周期有關的酶在EPO處理組和對照組并沒有明顯區別，由此可推測，EPO及受體在關于神經干細胞的增殖和分化起生理性的作用。Fu等〔30〕指出EPO不僅對神經細胞有保護作用，而且能調節其免疫抗原性。氨甲酰促紅細胞生成素能加強增殖的及分化的神經干細胞的MHC-I的抗原性，而減弱了MHC-II的抗原性。

3.2 EPO與間充質干細胞 間充質干細胞是來源于骨髓的具有多種風化潛能的干細胞，取材方便，免疫原性低，近年來對其誘導分化為各種終末細胞的研究較多，為進一步的臨床應用打下基礎。間充質干細胞是有別于骨髓中造血干細胞的一類細胞。其表面標志CD44，CD29陽性，而CD34，CD45為陰性。間充質干細胞，原代培養時生長較慢，有文獻報道，約14 d才能長滿培養皿的80%。張定國等〔31〕研究發現促紅細胞生成素能促進MSC增殖，效率呈劑量依賴性。正常組的MSC的G0/G1期比例較高，為90.2%，S期和G2/M期的比例相對較低，分別為6.5%，3%，經10 U/ml的EPO誘導后G0/G1期的比例下降(約73%)，S期和 G2/M期的比例相對增加(分別為約15%，12%)。王文益等〔32〕在體外構建 EPO的真核表達質粒 pEGFP-N1/EPO，然后將質粒轉染骨髓間充質干細胞，轉染后EPO成功在間充質細胞內表達，將轉染后的間充質干細胞移植到動物模型的腦缺血梗死區，MSC部分風化為了神經元細胞，減輕腦的功能損失，改善大腦的學習記憶功能。間充質干細胞在缺氧的條件下能對氧耐受較好，進一步研究表明缺氧后間充質干細胞的EPO受體表達增加。因此，EPO可能通過抗凋亡的作用增加間充質干細胞對缺氧的耐受能力。楊超等〔33〕通過慢病毒將EPO基因轉入間充質干細胞中，結果顯示EPO能穩定表達，并誘導間充質干細胞轉變為類胚胎干細胞，這種誘導的胚胎干細胞通過懸浮條件培養分化為造血系細胞。Danielyan等〔34〕提出EPO能保護間充質干細胞在不利其生長環境(比如缺氧、過量谷氨酸、β淀粉樣變性)，存活、神經細胞樣分化的功能。他們發現EPO能提高間充質干細胞的膽堿乙酰轉移酶及mAchR，使其分化為類膽堿能神經細胞。EPO通過激活Wnt3a保護間充質干細胞抵抗缺氧、高谷氨酸等，保護其功能。陳龍等〔35〕發現間充質干細胞表達EPOR受體，EPO能促進間充質干細胞的遷移，且在一定范圍能劑量依賴性。Yokoo等〔36〕用人的間充質干細胞培育出了能分泌EPO的器官，而且其分泌的EPO能改善貧血。Zwezdaryk等〔37〕也發現間充質干細胞表達EPOR，EPO能促進間充質干細胞向缺血區趨化，進而形成血管。EPO增加間充質干細胞的趨藥性、遷移性，激活基質金屬蛋白酶，有助于局部血管的形成。

3.3 EPO與造血干細胞 EPO作為造血調控因子已早有研究，它促進紅系祖細胞增殖，分化成熟。當造血干細胞異常時，如發生了骨髓增生異常綜合征時，研究發現外周學中的促紅細胞生成素顯著增加。正常人EPO主要在腎合成，它的釋放主要受EPO基因轉錄活性的調控。而EPO基因受HIF-2的調控。Shiozawa等〔38〕提出一個新的觀點:造血干細胞并不只是參與血液細胞的生成，它還與成骨密切相關。他們發現從動物分離來的造血干細胞經急性失血模式的調節后轉變成了成骨樣細胞。Li等〔39〕發現低氧環境和EPO協同作用使骨髓和脾的巨核紅系祖細胞增多，而巨核、粒系祖細胞減少。Perrotta等〔40〕發現造血干細胞EPOR發生突變，即第1251位的堿基由G突變為T之后，EPO的作用大大增加，使造血干細胞的增殖和分化為紅系細胞的能力大大提高，引來遺傳性紅細胞增多癥，并觀察到使循環中的內皮祖細胞提高了20倍。但Westenbrink等〔41〕發現在心衰病人，即使促紅細胞生成素正常，骨髓中造血干細胞分化形成的各系細胞都明顯低于正常對照組，由此說明在特定條件下，造血除與EPO有關外，還受很多其他因素的影響。Bullock等〔42〕發現人體內鐵的缺乏，會導致造血干細胞對EPO的反應減弱。Aguirre等〔43〕發現EPOR與骨髓造血密切相關，尤其機體受到某些影響骨髓造血功能的藥物影響時，EPOR的恢復是造血功能恢復的前提保障。Zakharov等〔44〕發現EPO促進造血干細胞增殖的強度與造血干細胞本身的分化成熟程度有關，他們發現培養有核紅細胞第一個24 h血島的增殖能力明顯強于晚期形成的血島。Huang等〔45〕發現EPOR敲除的小鼠的骨髓中紅系細胞、血小板都明顯減少，將一有功能的堿基序列變短的EPOR轉基因替代EPOR基因，能使小鼠骨髓紅系集落明顯增加。Klopsch等〔46〕的實驗表明給發生心肌梗死的小鼠心內直接注射EPO能募集CD34+、c-kit+干細胞到梗死區，減少梗死面積，增加梗死區的毛細血管密度，提高左心室的功能，降低右心室壁的壓力。Kapur等〔47〕發現紅系祖細胞表達EPOR，并且與c-kit相互作用。他們構建了GATA-1缺失的模型，發現干細胞因子刺激c-kit，使得EPOR及Stat5表達引起bcx-1的表達上調，維持紅系祖細胞的存活，促進紅細胞分化、成熟。

3.4 EPO與胚胎干細胞 胚胎干細胞是一類來自囊胚內細胞團的具有多向分化潛能的全能干細胞。在一定條件下，胚胎干細胞可以分化為神經細胞，血管內皮細胞，心肌細胞等，是細胞移植工程的重要“種子”細胞。有研究表明，胚胎干細胞能自分化為心肌樣細胞，但效率低下。王治等〔48〕研究表明rhEPO能誘導胚胎干細胞表達心肌細胞早期轉錄因子Nkx 2.5，GATA-4，1.0 U/ml的rhEPO組在誘導的第8天心肌細胞的分化率較自發分化組顯著增加。Glazova等〔49〕提出胚胎干細胞對脊髓損傷的修復在初期并不是依賴于EPO，他們將胚胎干細胞直接注入受傷小鼠的脊髓發現胚胎干細胞在向神經細胞分化的階段EPO的表達下降，而對照組的EPO表達上調。Boroujeni等〔50〕研究發現，經EPO干預過的胚胎干細胞不影響其歸巢能力，而且能增加其在造血器官的血細胞系集落的形成。他們將胚胎干細胞經尾靜脈注入小鼠體內，在其腎臟檢測到經EPO處理的造血系細胞集落約17.33，而對照組約6.1。Robey等〔51〕發現氨甲酰促紅細胞生成素能提高胚胎干細胞在心肌梗死模型的移植存活率，促進心臟功能的恢復。

3.5 EPO與內皮祖細胞 內皮祖細胞是一類骨髓來源的具有分化為成熟內皮細胞潛能的祖細胞。它主要參與血管的形成及血管內皮細胞損傷的修復。EPO能提高內皮細胞的增殖能力，并呈劑量依賴性。Ferri等〔52〕用rhEPO成功治愈了一例系統性硬化癥伴有皮膚潰瘍者，該患者經檢查發現骨髓內皮祖細胞明顯減少，并且增殖分化功能不足。經過6個月的rhEPO治療后，患者內皮祖細胞明顯增加，并且功能明顯恢復。Sautina等〔53〕發現EPO促進心肌細胞分泌血管生長因子，該生長因子促進心肌組織的內皮祖細胞增殖并形成血管，增加心肌血供，改善心肌功能。他們研究發現EPO上調心肌細胞的血管生長因子mRNA(VEGF mRNA)的表達，提高了心肌梗死區的血管密度達37%。若處理組加入VEGF的特異抑制物EPO改善心功能的作用則大大減弱。EPO能增加內皮祖胞的數量及功能，且這一功能是通過EPO與其細胞膜上的受體betaC-R結合，誘導NO的產生來實現的。

4 EPO作用的主要機制

4.1 EPO抗凋亡、促進細胞增殖及促進紅細胞成熟的機制EPO具有保護多種細胞抗凋亡的作用。EPO與EPO-R結合后可減少自由基的釋放，抑制鈣超載，抑制炎癥細胞的激活，發揮抗凋亡的作用。其還可通過激活JAK2，而后JAK2使EPO-R及STAT5激活PI3K，PI3K使AKT激活，活化的AKT使死亡相關蛋白(Bad)磷酸化，通過上調抗凋亡基因bcl-2，使bcl-2/bax的比值增大，caspase 3蛋白減少，減少細胞的程序性死亡。EPO調節細胞周期，使D1、D2期的細胞增加，抑制G2期，而且這一過程也通過EPO與EPOR結合后，激活JAK2，再激活STAT5信號通路完成。另外EPO可通過促進NOS的表達，間接調控細胞周期。EPO可通過如下途徑調節紅細胞的生成:它能與紅系祖細胞上的受體結合后刺激使其絲分裂，減緩CFU-E DNA的降解速率，激活紅系特異基因。同時EPO與造血干細胞上的相應受體結合后，使STAT5、STAT1磷酸化，激活AKT，MAPK，與GFI1B協同激活bcl，促進造血干細胞向紅系分化并促進其成熟，抑制成熟紅細胞的凋亡。在造血過程中，EPO受S3G/Spi2a及TRIB3調節。EPO也能通過激活JAK2后，NF-κB抑制因子(IκB)磷酸化，使其與 NF-κB 解離，從而 NF-κB 轉入核內調節下游基因的轉錄，上調凋亡抑制蛋白XIAP和c-CIAP2，阻斷caspase的合成發揮抗凋亡的作用。EPO與相應受體結合后可上調STAT1及EKLF轉錄子，進而上調抗凋亡蛋白，發揮抗凋亡作用。

4.2 EPO的神經保護機制 EPO限制活性氧家族和興奮性氨基酸的產生，誘導血管生成，保護細胞免受凋亡等機制，也是EPO發揮神經保護的重要的機制。除上述的機制外EPO還能調節突觸間傳遞信息的神經遞質。EPO通過調節細胞的鈣離子流，膜的去極化，神經遞質的合成等使神經干細胞在缺血缺氧的情況下對抗凋亡，有利于神經干細胞增殖并分化為神經元細胞以修復局部損傷。EPO可調節突觸的可塑性，激活鈣離子通道刺激多巴胺的釋放。EPO還可誘導NO的合成，而NO能促進興奮性神經遞質和抑制性神經遞質的釋放。也有研究報道是通過激活細胞膜上的T型Ca2+通道，使Ca2+內流增加，細胞內鈣的增加促進神經遞質的釋放。Sims等〔54〕研究發現EPO發揮神經細胞的保護作用時通過上調細胞谷胱甘肽的產生，進而發揮抗氧化損傷。

4.3 抗氧化的機制 EPO能抑制NO介導的氧化氧自由基的產生。EPO還能降低脂質過氧化反應，增強谷胱甘肽過氧化酶的活性。

4.4 促瘤生長的機制 雖然EPO促進腫瘤如神經膠質瘤生長的機制還不是很清楚，但有研究表明rhEPO與其受體相互作用后激活轉錄因子STAT3后腫瘤干細胞維持自我更新及不斷的增殖與分化。有研究發現，STAT3的激活能促進血管生長因子的釋放，促進血管的形成，也為腫瘤的生長創造了條件。

4.5 EPO促進成骨機制 EPO與造血干細胞上的EPOR結合后，激活JAK-SATA信號通路，使其表達BMP，促進成骨細胞的轉變。EPO也能直接刺激間充質細胞分化為成骨細胞。在成骨過程中，EPO可以直接先激活破骨細胞，然后再通過直接或間接刺激造血干細胞或是間充質細胞表達BMP，促進成骨。

5 總結和展望

目前的研究表明EPO不僅促進紅細胞的分化成熟，而且它作用于多種組織細胞，發揮促進其增殖，抗凋亡、抗氧化、抗炎的作用，以保持組織器官的結構和功能的完整性。除此EPO還調節干細胞，促進干細胞的增殖、分化，促進其向受損傷部位遷徙，在局部修復損傷組織。盡管目前EPO在臨床大量應用仍有導致血栓、高血壓等風險，但干細胞移植仍是心血管系統、神經系統損傷等修復最根本的治療，而目前干細胞在局部的移植組織處的存活及分化仍是研究的熱點。鑒于上述EPO的作用及將EPO氨甲酰化、小劑量應用，心血管系統的并發癥發生率低，EPO有望成為與干細胞協同治療損傷組織器官。但EPO與干細胞相互作用的機制還有待進一步研究，以及還需大量的動物實驗和臨床實驗。EPO在疾病治療方面將有廣闊的應用前景。

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