TLR4與抗磷脂綜合征血栓形成研究進展①

解鴻翔 周 紅

(江蘇大學基礎醫學與醫學技術學院，鎮江212013)

抗磷脂綜合征 (Antiphospholipid syndrome，APS)為一種非器官特異性自身免疫性疾病，主要臨床表現為復發性動靜脈血栓、習慣性流產和血小板減少等［1］，其中血栓形成是APS的主要病理基礎和最突出臨床表現，也是造成患者死亡的重要原因。前瞻性研究表明，雖然經過反復的抗凝治療，但APS患者仍然有顯著的發病率和死亡率［2］。本文對TLR4及其介導的信號通路在APS血栓形成中作用做一綜述，以期對APS病理機制有更好的理解，為APS治療提供新的方法。

1 TLR4及其介導的信號途徑

Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)是與微生物識別有關的天然免疫受體家族，屬模式識別受體，分布廣泛。TLR不僅通過選擇性地識別病原體中病原相關分子模式(Pathogen-associated molecular pattern，PAMP)的保守結構，實現對入侵病原體的早期識別，激活天然免疫，還可提供刺激分子和誘導T細胞分化的細胞因子，幫助機體建立獲得性免疫［3］。至今在人類已發現 11種 TLRs(TLR1～TLR11)，TLR4是第一個被認識的人類Toll樣受體蛋白。

TLR4屬于Ⅰ型跨膜蛋白，由細胞外區、跨膜區和細胞內區三個部分組成。其胞外區結構有富含亮氨酸的重復序列，負責識別不同的配體;胞內區與IL-1受體的胞內區相似，負責受體活化后的信號轉導，其中TIR區域是TLR4與其下游相關的信號轉導分子相互作用的關鍵部位。

目前已知TLR4介導的信號轉導包括MyD88依賴性和非依賴性途徑。TLR4與配體結合后發生二聚化，在MD-2分子的參與下，結構發生改變并募集下游的信號蛋白MyD88。MyD88通過其羧基(C)端與TLR4的TIR區發生同源性相互作用，其氨基(N)端的死亡結構域又招募IRAK4、未磷酸化的IRAK1，使兩者形成復合物，引起 IRAK1活化和 IRAK4自身磷酸化。隨后此復合物從MyD88上解離，與具有E3泛素連接酶活性的TRAF6相互作用。TRAF6與泛素結合酶13(Ubiquitin-conjugating enzyme 13，Ubc13)、泛素結合酶 E2變體1亞型 A(Ubiquitin-conjugating enzyme E2 variant 1 isoform A，Uev1A)結合，促使63位賴氨酸連接的多聚泛素鏈的合成，導致TAK1的激活。TAK1與TAB1(TAK1-binding protein 1)、TAB2(TAK1-binding protein 2)形成復合體，經IκB激酶(IKK1-IKK2-IKKγ)磷酸化激活NF-κB或經p38、JNK等促分裂原活化的蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)途經活化激活蛋白-1(Activator protein，AP-1)，誘導細胞因子如 IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、TNF-α、干擾素(Interferon，IFN)和粘附分子等基因的表達［3，4］。TRIF 是TLR4激活后TIR結構域募集的另一接頭蛋白，其介導的信號途徑又稱MyD88非依賴途徑或TRIF依賴途徑。TRIF分子通過250-255位氨基酸構成的T6BM結構域和661-699位氨基酸構成的RHIM結構域分別結合TRAF6和RIP1(Receptor-interacting protein 1)，后兩者可獨立介導 TRIF途徑的NF-κB激活過程。TRIF與RIP1結合后還可以通過Fas相關死亡結構域(Fas associated death domain，FADD)，活化caspase信號轉導途徑，最終導致細胞凋亡的發生。此外，TRIF也可以與TBK-1及IKKε結合，后兩者可作為IRF3的激酶使IRF3活化，誘導包括IFN-β在內的一系列基因的轉錄。

TLR4主要表達于單核巨噬細胞、粒細胞、樹突狀細胞、淋巴細胞、內皮細胞，以骨髓單核細胞的表達為多。TLR4作為人類天然免疫的重要受體，可以識別多種配體，最主要的是來源于細菌的脂多糖(LPS)，此外還能識別呼吸道合胞病毒蛋白F、分枝桿菌成分、熱休克蛋白、纖維結合蛋白、肝素、透明質酸酶、纖維蛋白原等。作為調節機體免疫功能的重要分子，在特定條件下，TLR4可異常高表達并過度激活，導致機體功能紊亂，引發各種疾病，包括自身免疫性疾病。

2 β2GPI與細胞表面受體

大量研究表明，APS患者血清中的高滴度的抗磷脂抗體(antiphospholipid antibody，aPL)與其病理機制密切相關。但aPL針對的靶抗原不是磷脂，而是一大類吸附于陰離子表面的磷脂結合蛋白，其中β2糖蛋白I(beta-2-glycoprotein I，β2GPI)是aPL的關鍵靶抗原。臨床研究顯示多數反復發生血栓的患者可檢測到抗β2GPI抗體，經親和純化的APS患者來源的抗β2GPI抗體能誘導小鼠血栓形成［5，6］?？功?GPI抗體可通過β2GPI依賴的方式激活血管內皮細胞，使其上調細胞粘附分子(E-selectin、ICAM-1、VCAM-1)的表達，分泌和釋放促炎性因子(IL-1β、IL-6、IL-8、MCP-1、TNF-α)和組織因子(Tissue factor，TF)等，也可以刺激血液單核細胞分泌炎癥因子和表達TF［7-10］。其中TF在APS血栓形成中扮演關鍵角色。TF為貫穿于細胞膜的單鏈糖蛋白，可以作為凝血因子Ⅶ/Ⅶa的受體，以TF/Ⅶa復合物的形式激活凝血因子Ⅸ、Ⅹ，從而引發血液凝固。

過去的研究表明，β2GPI不是簡單的綁定細胞表面帶負電荷的磷脂，而是通過特殊的受體結合到細胞表面。體內和體外研究表明膜聯蛋白A2(Annexin A2)是β2GPI的高親和力受體，將β2GPI連接在靶細胞上，介導aPL誘導的病理效應［11-13］。Annexin A2，內皮細胞表面組織型凝血酶原激活物的受體，是一種無跨膜區域的膜蛋白，不能單獨誘導胞內信號通路。因此Annexin A2可能需要一種可以誘導胞內信號的“銜接蛋白”(或共受體)。近期研究發現，跨膜蛋白TLR4可能充當這種角色。

3 TLR4與aPL誘導的細胞激活:體外研究

3.1 內皮細胞 Raschi等［14］人運用內皮細胞株HMEC-1研究發現，APS病人來源的抗β2GPI單克隆抗體和經過抗原純化的抗β2GPI多克隆抗體與LPS或IL-1激活內皮細胞后具有相同的信號通路。MyD88或 TRAF6敲除之后，抗 β2GPI抗體與 LPS或IL-1失去誘導的內皮細胞NF-κB活化的能力，對IRAK磷酸化研究顯示LPS和抗β2GPI抗體具有相同時間動態。Raschi等的研究結果說明β2GPI抗原抗體復合物綁定內皮細胞后，可通過與Toll樣受體(TLR)有關的MyD88依賴途徑導致NF-κB活化，并提示有可能是TLR4在信號通路中起到關鍵的作用。

這些數據并沒有證明TLR4直接綁定β2GPI，還是由于其它細胞表面受體與β2GPI結合，TLR4作為共受體激發胞內信號通路。Zhang等［15］在隨后的實驗中將內皮細胞HUVEC來源的Annexin A2經親和純化后固定在Affi-Gel HZ柱上，通過洗脫、SDS-PAGE和LC-MS分析后發現TLR4能與Annexin A2發生免疫共沉淀。這些發現初步證實TLR4可能參與Annexin A2介導β2GPI抗原抗體復合物激活內皮細胞。

最近，Allen等［16］進一步證實TLR4在抗β2GPI抗體激活內皮細胞過程中扮演關鍵角色。TLR4可以和Annexin A2、calreticulin及 nucleolin以多聚蛋白信號復合體的形式存在于在靜息的HUVEC表面，在羊抗人β2GPI抗體激活HUVEC過程中多聚蛋白信號復合體表達增加，通過RNA干擾技術敲除此多聚蛋白信號復合體中任一蛋白的表達，均會明顯抑制抗β2GPI抗體誘導的內皮細胞 E-selectin、ICAM-1、VCAM-1、TF mRNA 表達及 NF-κB 活化。然而Calreticulin和nucleolin在抗β2GPI抗體激活內皮細胞過程中的具體生物學功能并不清楚。

3.2 單核細胞 抗β2GPI抗體激活內皮細胞是APS血栓病理形成機制的其中一個假說［17］。單核細胞表面也存在抗β2GPI抗體，它通過Annexin A2和TLR4作為受體進行交叉反應。Sorice等［10］研究表明靜息狀態下的人單核細胞脂筏內，β2GPI以二聚體的形式與Annexin A2相互結合。LPS或來源于有血栓史APS病人血漿的抗β2GPI抗體激活單核細胞后，TLR4也被招募進脂筏并與β2GPI二聚體相互作用，β2GPI發生二聚化并且與被招募進脂筏的TLR4相互作用，導致IRAK磷酸化和NF-κB轉位，最終導致細胞釋放TNF-α和TF，引起促炎癥反應和血液高凝。TLR4與β2GPI結合需要脂筏的完整性，脂筏破裂劑 mβCD可以減少 TLR4與β2GPI結合，抑制抗 β2GPI抗體誘導的 IRAK磷酸化。

本課題組對于TLR4在抗β2GPI抗體激活單核細胞中的作用進行了探討。實驗中用兔抗體人β2GPI抗體刺激人單核細胞株THP-1，并加入外源性人β2GPI共同孵育，結果發現，β2GPI抗原抗體復合物能夠產生與LPS相同的刺激效應，顯著增加細胞 TLR4、MD-2和 MyD88 mRNA及蛋白表達水平，誘導IRAK1磷酸化和TRAF6泛素化，最終導致TF mRNA 表達增強、活性增高［18，19］。為充分闡明TLR4及其信號分子在β2GPI抗原抗體復合物刺激THP-1細胞表達TF中的作用，我們還采用TLR4途徑抑制劑--紫杉醇，觀察對細胞表達上述分子的影響。紫杉醇(paclitaxel)是一種常見的抗癌藥，可以通過與MD-2結合，掩蓋TLR4配體的受體結合位點而起到抑制 TLR4信號通路的作用［20，21］。利用紫杉醇這一特性，觀察紫杉醇是否干預β2GPI抗原抗體復合物對THP-1細胞的作用。結果證明，紫杉醇不僅抑制了β2GPI抗原抗體復合物誘導的TLR4、MD-2、MyD88表達，也抑制了 IRAK1磷酸化和TRAF6泛素化，同時也干預了細胞TF的表達。

我們通過β2GPI-Affi-Gel柱親和層析證明Annexin A2和TLR4均可以與β2GPI在THP-1細胞表面發生結合。慢病毒 LV-Annexin A2-RNAi干擾THP-1細胞后，β2GPI抗原抗體復合物刺激細胞TLR4、MyD88及MD-2表達的作用明顯減弱，IRAKs和TRAFs表達和活性被抑制，最終也干預了細胞TF的表達。我們認為THP-1細胞表面TLR4部分依賴Annexin A2，在β2GPI抗原抗體復合物誘導THP-1細胞表達TF過程發揮重要作用［18，19］。

4 TLR4與aPL誘導的血栓:體內研究

為了證實TLR4在aPL誘導內皮細胞激活和體內血栓形成中的作用，Pierangeli等［22］觀察了aPL誘導LPS非反應性小鼠(C3H/HeJ小鼠)血栓形成的能力。C3H/HeJ小鼠細胞由于編碼TLR4胞內段的基因區發生錯意點突變而不能對LPS作出反應。與健康患者IgG片段和aPL陰性SLE患者IgG片段相比，APS患者中的IgG片段引起LPS+/+小鼠產生更大的血栓，小鼠提睪肌微循環中的內皮細胞上黏附了更多白細胞。這些效應通過親和層析去除抗β2GPI活性后消失。與 LPS+/+小鼠小相比，LPS-/-小鼠注射IgG-APS后產生更小的血塊，黏附更少的白細胞，頸動脈勻漿中產生更少的TF。這些發現強有力地說明了aPL介導的血栓形成效應，aPL特別是抗β2GPI在體內能激活內皮細胞，TLR4基因自發突變導致的細胞信號通路缺陷能顯著降低aPL誘導血栓效應。

5 二次打擊理論與TLR4的保護性基因多態性

雖然APS被認為是一種自身抗體介導的疾病，抗磷脂抗體在APS中起主要作用，但臨床觀察發現，APS患者血液中持續表達aPL，而血栓形成只是偶爾發生。因此提出二次打擊理論，認為aPL形成的第一次打擊是血栓形成的高危因素，而臨床血栓發生還需要其他條件形成二次打擊。

前期的實驗表明aPL誘導的APS動物模型發生血栓需要炎癥形成的再擊效應，如機械創傷和注射 LPS［22，23］。APS 患者急性血栓形成通常和近期感染有關。研究表明LPS能增強aPL誘導中性粒細胞表達L-選擇素、IL-8，并能與 β2GPI結合導致TLR4依賴的巨噬細胞活化［24，25］。這些證據表明炎癥作為第二種致擊物，引發aPL相關的血栓事件發生。TLR4對誘導快速炎癥反應和激活免疫系統的效應細胞起到關鍵作用。由于TLR4基因多態性可能減弱對配體的快速反應，在細胞水平減弱炎癥應答，從而改變感染性疾病和炎癥性疾病的易感性［26］。

“保護性”的TLR4單核苷酸多態性(Single nucleotide polymorphism，SNP)同樣導致APS病人aPL誘導血栓形成效應的不同易感性。Pierangeli［22］的數據顯示有血栓史的APS患者TLR4 Asp299Gly和Thr399Ile突變的頻率顯著低于有同樣突變的健康質控。Cimaz等［27］調查了 IL-1β、TNF-α、TGF-β、IL-6、IFNγ、IL-10和TLR4基因多態性的家族分布。非保護性野生型TLR4基因和高促炎癥反應相關的細胞因子多態性(IL-1β promoter-511 C/T;TNF-α G/A;TGFβ +10 T/C，+25 C/G;IL-6-174 C/G)僅存在于反復發生血栓的先證者，而保護性TLR4基因多態性更多的出現在無癥狀的aPL攜帶者。總之，APS患者炎癥反應中的保護性TLR4基因多態性將減少炎癥因子激發炎癥反應的級聯放大效應，使aPL陽性患者發生血栓的風險性降低。

6 TLR4介導的信號轉導通路的相關阻斷研究與APS治療

目前針對APS的治療，主要是依賴長期的抗凝防止血栓發生，及孕期使用肝素和阿司匹林防止流產。這些治療并非有效，有出血等副作用，因此迫切需要新的治療方法，特異性干預APS病理過程。隨著對TLR4介導的信號轉導通路在APS發病機制中的作用的不斷深入，在治療方面除傳統藥物外，抑制此通路的關鍵環節或關鍵分子以抑制APS病人的血栓發生是眾多學者研究的新方向。

體外實驗表明，β2GPI和TLR4間的交叉反應在誘導細胞激活和APS促凝血表型中起關鍵作用，脂筏破裂劑mβCD、TLR4封閉抗體和TLR4干擾RNA等任何可以介入該機制的方法均可用于阻斷或降低aPL介導的“第一次打擊”，阻斷或減少aPL誘導的血栓效應和炎癥反應［10，16，28］。TLR4 下游重要的信號分子MyD88、IRAK1和 TRAF6在 APS中的作用也已經證明，抑制這些關鍵分子的表達或活性，同樣可以阻斷aPL誘導TLR4信號轉導，最終減少TF表達［2，29，30］。

MAPK途徑和NF-κB途徑作為包括TLR4信號通路在內的多條信號通路的終末途徑，在APS病理機制中的關鍵角色在體內和體外實驗中都已得到證實，其中P38 MAPK、ERK1/2參與aPL誘導的血小板和多種細胞的激活，而JNK的作用尚無定論［31］。雖然小鼠體內實驗證實抑制 P38 MAPK、NF-κB能顯著減少aPL誘導的血栓發生，但由于MAPK途徑和NF-κB途徑存在復雜的調控，臨床治療的長期有效性還需進一步觀察。由于APS患者需要長期抗凝治療，TLR4作為固有免疫的重要防線，因此在進行針對TLR4及其信號途徑的免疫治療時，還要考慮治療的安全性。APS患者aPL介導的血栓發生與TLR4基因多態性存在關聯，因此TLR4多態性分析可以作為一種新工具對APS患者發生血栓的可能性重新評估，并以此調整抗凝藥物的用量。

7 結語

綜上所述，TLR4在APS的發生、發展中發揮著重要作用，為深入闡明該病的發病機制和拓展治療方法提供了新的方向。TLR4的研究仍然存在許多問題，目前主要局限于基礎研究，真正能應用于臨床的成果尚少，如何提高APS血栓和流產的防治效果并研究新的治療方案有待進一步探討。

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