抗髓過氧化物酶及乳鐵蛋白抗體對自身免疫性肝炎檢測的臨床研究①

譚立明 張玉紅 陳冬蓮 明 鳳 李 華 陳娟娟 王外梅 熊金旺

(南昌大學第二附屬醫院檢驗科，南昌330006)

自身免疫性肝炎(Autoimmune hepatitis，AIH)是一組典型組織學表現為界面性肝炎(碎屑樣壞死)、血清轉氨酶升高、高球蛋白血癥、自身抗體檢測呈陽性、病毒指標呈陰性的慢性炎癥，可合并肝外自身免疫性疾病［1，2］。現多認為由免疫遺傳背景加上環境因素刺激引起免疫耐受缺陷和體內免疫微環境平衡紊亂而導致的以自身肝細胞為靶抗原的自身攻擊現象［3，4］，發病機制尚不明確。本研究通過檢測 AIH與非AIH患者血清中抗髓過氧化物酶抗體(Antimyeloperoxidase antibody，AMPA)、抗乳鐵蛋白抗體(Anti-lactoferrin antibody，ALA)等自身抗體，探討AMPA、ALA等自身抗體對AIH檢測的臨床意義，旨在發現潛在血清學指標，提高AIH的診斷水平以及為進一步研究AIH發病機理提供依據，研究報告分析如下。

1 材料與方法

1.1 材料來源 63例AIH及206例非AIH患者來自南昌大學第二附屬醫院自2008年7月至2012年6月門診、住院確診病例。63例AIH患者中男性9例，女性54例，年齡為4～69歲，平均為43歲;206例非AIH分別為:36例原發性膽汁性肝硬化(Primary biliary cirrhosis，PBC)中男性6例，女性30例，年齡為31～69歲，平均為49歲，25例原發性硬化性膽管炎(Primary sclerosing cholangitis，PSC)中男性19例，女性6例，年齡為21～61歲，平均為39歲;61例乙型肝炎(Hepatitis B，HB)中男性29例，女性32例，年齡為18～60歲，平均為38歲，53例丙型肝炎(Hepatitis C，HC)中男性27例，女性26例，年齡為20～59歲，平均為41歲，31例戊型肝炎(Hepatitis E，HE)中男性11例，女性20例，年齡為18～60歲，平均年齡為47歲;對照組50例均為南昌大學第二附屬醫院體檢中心健康體檢者，男性15例，女性35例，年齡為23～57歲，平均年齡為33歲。均獲得患者以及證明為無病健康體檢者的許可，所有入選者均簽署知情同意書。

1.2 診斷依據 ①自身免疫性肝病AIH、PBC、PSC診斷綜合參考國際診斷標準［5］;②病毒性肝炎診斷參考衛生部2008年更新的病毒性肝炎診斷指南［6］。

1.3 納入標準 2007年7月至2012年6月在南昌大學第二附屬醫院確診的AIH及非AIH患者，自愿成為研究對象且符合以下條件者予以納入:①臨床資料齊全且具有肝組織學病理資料;②自身免疫性肝病患者至少兩次檢測病毒性標志物為陰性;③對所有自愿參與病人的資料重新評估，無血色病、抗胰蛋白酶缺乏癥、Wilson病等其他遺傳性肝損疾病;④年齡在4～70歲，均符合本研究參考的診斷指標。

1.4 排除標準 凡有下列情況者予以剔除:①沒有完整臨床資料或肝組織學病理資料;②發病前有明確服用肝毒性藥物史，酒精性脂肪肝病史，大量飲酒史，惡性腫瘤史;③患有血色病、抗胰蛋白酶缺乏癥、Wilson病等其他遺傳性肝損疾病;④合并糖尿病、痛風、苯丙酮尿癥;⑤妊娠或哺乳期婦女;⑥失代償期肝硬化;⑦不愿成為研究對象。

1.5 試劑和方法

1.5.1 標本的采集 標本均為空腹采集不抗凝血2.0 ～3.0 ml，以2 500 r/min 速度離心15 分鐘分離血清，－20℃冷凍待檢。

1.5.2 檢測方法 AMPA、ALA檢測采用德國歐蒙公司生產的ELISA法試劑，操作過程為將樣品稀釋，按加樣方案向相應微孔中分別加稀釋血清、陰性、陽性對照和空白對照各100 μl，室溫溫育30分鐘，洗板3次，加酶標抗體100 μl再室溫溫育30分鐘，同前洗板3次。加底物顯色，5分鐘后加終止液，用450 nm波長比色，計算結果。抗核抗體(Anti-nuclear antibodies，ANA)、抗平滑肌抗體(Antismooth muscle antibodies，ASMA)、抗中性粒細胞胞質抗體(Anti-neutropil cytoplasmic antibodies，ANCA)檢測的試劑盒由德國歐蒙公司生產，ANA選擇Hep-2細胞和猴肝作為抗原;ASMA抗體采用大鼠胃的冰凍組織切片;ANCA采用在生物薄片馬賽克上覆有中性粒細胞(乙醇或甲醛固定)、Hep-2細胞和猴肝四種基質的復合片，4℃保存備用。實驗設計采用完全空白對照，操作方法嚴格按試劑說明及科室作業指導書進行操作。

1.6 統計學分析 應用SPSS16.0軟件進行統計分析，計數資料以例數(百分比)描述，組間單因素分析采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有顯著性統計學意義，P＜0.01為差異有非常顯著性統計學意義。并對AIH患者各種自身抗體的敏感性、特異性、有效性、陽性預測值、陰性預測值、陽性似然比和陰性似然比等指標進行臨床評價，有效性=(真陽性+真陰性)/(病例組+對照組);特異性=真陰性/對照組;敏感性=真陽性/病例組;陽性預測值=真陽性/陽性組;陰性預測值=真陰性/陰性組;陽性似然比=真陽性率/假陽性率;陰性似然比=假陰性率/真陰性率。

2 結果

2.1 AIH與非AIH對AMPA、ALA等自身抗體的檢測 63例AIH、206例非AIH及50例健康體檢者檢測AMPA、ALA、ANCA、ASMA及ANA結果顯示，AIH組AMPA陽性率為61.9%(39/63)，與非AIH及對照組比較均有統計學差異，P＜0.01;AIH組ALA陽性率為19.0%(12/39)，非 AIH組陽性率0.5%(1/206)，組間比較 P＜0.01，PSC 組有1例陽性(4.0%)，與 AIH 組比較 P＞0.05;ASMA 陽性率最高為68.3%，ANA陽性各組均有檢出，與非AIH各組比較均P＜0.05，詳見表1。

2.2 AIH患者AMPA、ALA等自身抗體檢測的各項試驗評價指標 AMPA、ALA、ANCA、ASMA及ANA在AIH患者中各項臨床試驗指標顯示ALA、AMPA特異性分別高達99.61%、97.2%，但敏感性ALA最低為19.05%，詳見表2。

表1 AIH 及非AIH 患者AMPA、ALA、ANCA、ASMA和ANA檢測結果［例(%)］Tab.1 AIH and non AIH patient’s results in detected by AMPA，ALA，ANCA，ASMA and ANA［n(%)］

表2 AMPA、ALA、ANCA、ASMA及ANA在AIH患者臨床評價指標比較Tab.2 The clinical indexes of AMPA，ALA，ANCA，ASMA and ANA in AIH

表3 AIH各亞型患者AMPA、ALA、ANCA、ASMA和ANA陽性結果［例(%)］Tab.3 Different subtypes of AIH patient’s results in detection of AMPA，ALA，ANCA，ASMA and ANA positive results［n(%)］

表4 AMPA、ALA、ANCA、ASMA 及 ANA 在 AIH-Ⅰ患者臨床評價指標比較Tab.4 The clinical indexes of AMPA，ALA，ANCA，ASMA and ANA in AIH-Ⅰ

2.3 AIH各亞型患者AMPA、ALA等自身抗體的檢測 AIH患者AIH-Ⅰ組AMPA陽性率73.6%(39/53)，AIH-Ⅱ組AMPA陽性為零，組間比較P＜0.01;AIH-Ⅰ組 ALA 陽性率 20.8%(11/53)，AIH-Ⅱ組ALA陽性率 10.0%(1/10)，組間比較 P＞0.05;AIH-Ⅰ組檢測ANCA陽性率77.4%(41/53)，ASMA陽性率75.5%(40/53)，ANA陽性率71.7%(38/53)，與AIH-Ⅱ組間比較均P＜0.01。相關性分析，經 χ2檢驗，AIH-Ⅰ型中 AMPA 與 ANCA、ASMA、ANA比較，均為P＜0.01，ALA與各抗體比較均P＞0.05;AIH-Ⅱ組 ALA 與 AMPA、ANCA、ANA 比較均為 P ＜0.05，與 ASMA 比較 P ＞0.05，詳見表3。

2.4 AIH-Ⅰ中AMPA、ALA等自身抗體檢測的各項試驗評價指標 AMPA、ALA、ANCA、ASMA及ANA在AIH-Ⅰ患者中各項臨床試驗指標顯示特異性AMPA、ANCA均最高為100%，ALA為98.33%，但ALA敏感性最低為20.75%，陽性預測值 AMPA、ANCA均最高為100%，ALA為91.67%，陽性似然比AMPA、ANCA均最大，詳見表4。

3 討論

隨著免疫學、病毒學、分子生物學等臨床診斷水平的不斷提高，AIH的診斷已不再罕見，該病多發于女性［3］，免疫抑制劑治療通常有一定療效，但嚴重病例若不及時治療六個月死亡率將高達40%。與其他肝病相比AIH無明顯特異性而常導致誤診［7］，等確診接受正確治療時已發展為肝硬化。AIH患者體內產生各種自身抗體，ANCA就是其中一種，髓過氧化物酶 (Myeloperoxidase，MPO)、乳鐵蛋白 (Lactoferrin，LF)均為ANCA的靶抗原。MPO是血管中活化的中性粒細胞、單核細胞、巨噬細胞分泌的血紅素蛋白酶，近年來研究發現MPO基因的多態性與多種疾病的易感性有關［8］，表明中性粒細胞活化后聚集至腎臟并大量釋放 MPO［9，10］，認為 AMPA 與腎臟損傷改變密切相關，AMPA是否同樣與AIH患者肝臟受損密切相關呢?在急性炎癥疾病時，ALA水平會增高。研究發現中性粒細胞中的一些顆粒蛋白(除蛋白酶-3和MPO)相應的自身抗體可作為潛在的血清自身抗體指標，如ALA［11］。自身抗體的產生是AIH的特點之一，因此，找到更多具有高敏感性或疾病特異性的血清自身抗體對AIH的診斷與鑒別有重要意義。

筆者對63例AIH患者檢測血清AMPA、ANCA、ASMA及ANA等自身抗體，陽性率分別為61.9%、65.1%、68.3%、60.3%，結果與報道相符［12，13］，與非 AIH相比，P＜0.01;AIH中 ALA陽性率為19.05%，與非AIH比較P＜0.01，且非AIH組中僅發現PSC中有1例ALA陽性，其余均為陰性，并且AIH各項評價指標顯示特異性為ALA最高99.6%，AMPA為97.27%，ASMA除特異性與陰性似然比均最高，ANA檢測在AIH組陽性率60.3%，PBC組陽性率33.3%，PSC組陽性率32.0%，HCV組陽性率為24.5%，HBV陽性率為 9.8%，HEV陽性率為9.7%;ASMA檢測在AIH組陽性率為68.3%，PBC組陽性率為5.6%，其余組為零，與王愛莉等人的報道基本一致［14-16］。抗體間相關性分析，經χ2檢驗:AIH組，AMPA與ANCA、ASMA比較均為P＜0.05，ALA與其余抗體比較為P＞0.05;AIH-Ⅰ組，AMPA與ANCA、ASMA、ANA 比較均為P ＜0.01，ALA 與各抗體比較P＞0.05。說明AMPA診斷AIH的價值優于ANCA、ASMA，ALA的診斷價值與NCA、ASMA及ANA相當，AMPA鑒別AIH-Ⅰ有非常顯著性意義，AMPA、ALA聯合 ANCA、ASMA及 ANA抗體檢測對AIH的鑒別診斷有重要意義，AMPA及ALA等自身抗體與AIH的發生發展密切相關。

ANCA是以中性粒細胞胞質為靶抗原的自身抗體，分為核周型抗中性粒細胞胞質抗體(p-ANCA)和核質型抗中性粒細胞胞質抗體(c-ANCA)。p-ANCA的靶抗原主要是MPO，MPO為中性粒細胞功能與活化的標志，MPO不但能殺滅細胞內的微生物還能釋放到細胞外，破壞多種靶物質，在機體調節和產生炎癥反應等諸多方面發揮作用。研究發現，p-ANCA與MPO結合后，MPO功能受到抑制，導致中性粒細胞大量活化，呼吸爆炸，脫顆粒，產生大量過氧化物和超氧化物，致使炎癥組織細胞損害;p-ANCA也可通過刺激血管內皮細胞使E-選擇素、血管黏附分子-1及細胞間黏附分子-1等黏附分子的表達增加，從而干擾MPO抑制物血漿銅藍蛋白的滅活，引起組織損傷。AIH發病機制尚不明確，AMPA是否與AIH存在相關性呢?筆者檢測63例AIH患者血清AMPA抗體陽性率為69.1%，與非AIH各組比較，P＜0.01，差異有非常顯著性意義;AIH亞型AIH-Ⅰ AMPA陽性率為73.6%，而 AIH-Ⅱ及健康組AMPA均無1例陽性，與文獻［17］報道基本一致，說明AMPA與AIH特別是與AIH-Ⅰ有密切關系，其具體機制有待進一步研究。

LF是由中性粒細胞顆粒釋放的一種鐵結合糖蛋白［18］，存在鼻腔分泌物、唾液、眼淚、初乳、陰道分泌物、精液等體液中，是人體免疫系統第一道戰線上的勇士［19］，研究發現 LF有特異的免疫調節功能［16-20］，主要與其靶細胞表面的特異性受體有關，單核細胞、淋巴細胞、血小板、肝細胞、乳腺表皮細胞及腸上皮細胞的表面均發現有LF受體［21］，LF能與細胞表面受體結合從而發揮免疫功能;LF與脂多糖(LPS)有很高的親和力［22］，可以和LPS-結合蛋白競爭性結合LPS，從而阻止LPS向單核細胞表面的補體CD14傳遞，發揮免疫調節功能，LF還能抑制炎癥區血管內皮細胞內IL-8的轉錄和表達，調節白細胞在炎癥區的聚集，抑制毒血癥的發生。總之，LF具有促進中性粒細胞吸附聚集于炎癥部位、增加粒細胞黏附作用、抗氧化、調節免疫球蛋白分泌、抑制補體系統的激活或激活已有的補體、參與調節機體免疫耐受能力以及促進細胞間相互作用等一系列功能［23，24］。筆者假設中性粒細胞被激活，脫顆粒從而釋放LF，與肝細胞表面的LF受體結合，同時大量中性粒細胞聚集，機體免疫耐受能力下降，導致ALA攻擊肝細胞從而導致肝損傷。筆者檢測63例AIH與206例非AIH患者血清中ALA陽性率分別為19.0%，0.5%，經 χ2檢驗，P ＜0.01，差異有非常顯著性統計學意義，而非AIH中僅僅PSC組中檢出1例ALA陽性，其余組ALA檢測均為陰性，AIH各項臨床評價指標顯示ALA特異性為最高達99.61%，有效性為83.70%，陽性預測值為92.31%，陰性預測值為83.33%，但在其他指標評價均很高的情況下，ALA的敏感性卻最低僅為19.05%，充分證明ALA的檢測對診斷AIH有非常高的特異性，優于在其他自身免疫性肝病。

最新研究表明根據血清自身抗體可以將AIH分為兩種亞型，AIH-Ⅰ最常見，以ANA和(或)ASMA陽性為主要特征;AIH-Ⅱ多見于兒童，也可伴ANA和(或)ASMA陽性［3］。本研究結果顯示AM-PA檢測在 AIH-Ⅰ患者中陽性率73.6%，和文獻［25］報道相符，與AIH-Ⅰ和健康對照組比較P＜0.01，差異有非常顯著性統計學意義;AIH-Ⅰ組經檢測ALA陽性率20.8%，與健康組比較P＜0.05，差異有顯著性意義;AIH-Ⅰ各項評價指標顯示特異性為AMPA、ANCA最高100%，ALA為98.33%，陽性預測值AMPA、ANCA最高100%，同樣ALA敏感性最低為20.75%，AIH各項評價指標顯示除特異性和陰性似然比外均為ASMA最高，敏感性68.25%，有效性93.10%，陽性預測值95.5%，陰性預測值92.70%，陽性似然比 87.37。所以 AMPA、ALA 聯合ANCA、ASMA及ANA等自身抗體檢測對AIH亞型的鑒別診斷有一定價值。

某些藥物引起的肝損害患者常能檢測到自身抗體陽性，如抗ANA、ASMA等抗體，臨床表現為慢性肝炎癥狀、發熱、高球蛋白血癥、關節疼痛等慢性肝病體征，同樣主要為女性患者，與AIH很難鑒別，近年來極受國內外學者關注。Bjornsson等［26］發現藥物誘導的AIH與經典AIH在自身抗體、肝功能指標、免疫球蛋白、組織學、性別以及年齡上差異無統計學意義，導致誤診誤療。也有研究表示病毒感染也會誘導產生自身免疫現象，與自身免疫性肝炎可出現類型相似的自身抗體［27，28］，常導致誤診。本研究顯示，ALA檢測AIH組陽性率19.0%，非AIH組陽性率 0.5%，經 χ2檢驗，P ＜0.05，差異有顯著性意義，非AIH組中僅僅PSC組發現1例陽性，這表明ALA聯合原始血清自身抗體檢測對鑒別診斷AIH與非AIH有非常重要的價值，可能是鑒別AIH和藥物性自身免疫性肝炎(DIAIH)或者其它自身免疫性疾病以及病毒性肝炎的潛在武器。

綜上所述，AMPA、ALA與 AIH有一定的相關性，是診斷AIH的有效血清學自身抗體檢測指標，聯合ANCA、ASMA及ANA等自身抗體的檢測對AIH的診斷與鑒別診斷有重要意義。AMPA、ALA與AIH有密切關聯，內在機制有待進一步研究。

1 Czaja A J，Manns M P.Advances in the diagnosis，pathogenesis，and management of autoimmune hepatitis［J］.Gastroenterology，2010;139(1):58-72.

2 Muratori L，Muratori P，Granito A et al.Current topics in autoimmune hepatitis［J］.Dig Liver Dis，2010;42(11):757-764.

3 Vgani D，Longhi M S，Bogdanos D P et al.Autoimmune hepatitis［J］.Semin Immunopathol，2009;31(3):421-435.

4 Manns M P，Czaja A J，Gorham J D et al.Diagnosis and management of autoimmune hepatitis［J］.Hepatology，2010;51(6):2193-2213.

5 De-kai Qiu，Qi-xia Wang.Validation of the simplified criteria for diagnosis of autoimmune hepatitis in Chinese［J］.J Hepatol，2011;54(2):340-347.

6 中華人民共和國衛生行業標準.中華人民共和國衛生部.傳染病診斷標準［S］.2008;(WS):298-301.

7 Lohse A W，Wiegard C.Diagnostic criteria for autoimmune hepatitis［J］.Best Pract Res Clin Gastroenterol，2011;25(6):665-671.

8 Polonikov A V，Solodilova M A，Ivanov V P.Genetic variation of myeloperoxidase gene contributes to atopic asthma susceptibility:a preliminary association study in Russian population［J］.J Asthma，2009;46(5):523-528.

9 Liu C G，Gao H K.Changes and significance of neutrophils in the experimental mice toxic in renal injury［J］.J Dalian Med University，2011;32(2):111-115.

10 LIAO Y Q，PENG K J，LIU J R et al.Clinical significance of antineutrophilcytoplasmic antibody monitoring in patients with concurrent rheumatoid arthritis and crescentic glomerulonphritis［J］.Int J PATHOL Clin Med，2012;32(2):104-109.

11 Deniziaut G，Ballot E.Antineutrophil cytoplasmic auto-antibodies(ANCA)in autoimmune hepatitis and primary sclerosing cholangitis［J］.Clin Res Hepatol Gastroenterol，2013;37(1):105-107.

12 TAN L M，WANG Y Y，Li H et al.A survey of auto-antibodies in 161 patient with autoimmune liver diseases［J］.Immunol J，2012;28(12):1061-1064.

13 WONG K G，CAO W K，ZHANG Y M et al.Significance of detection of autoantibodies in autoimmune liver disease in patients with hepatic dysfunction［J］.J Practical Med，2012;28(11):1885-1887.

14 Wang Ai-li.Analyse the results of test autoantibody in 92 cases of autoimmune hepatitis Clinical［J］.Int J Lab Med，2011;32(11):1240-1241.

15 Wang Rong，Geng Xiu － rong，Tan Sha et al.The feature of autoan tibodies in hepatitis C and autimmune hepatitis［J］.Sichuan Med J，2011;32(2):253-255.

16 Dong Min，Zou Hou-qin，Wu Jing-bin.Detection and clinical significance of serum anti-nuclear antibodyes in patients B virus infection［J］.Lab Med，2012;27(5):374-375.

17 Tan Li-ming，Peng Wei-hua，Dong Ye et al.Clinical value of antimyeloperoxidase antibody on diagnosis of autoimmune hepatitis［J］.J Immunol，2009;25(6):697-704.

18 Legrand D，Elass E，Carpentier M et al.A modulator of immune and inflammatory responses［J］.Cell Mol Life Sci，2005;62(22):2549-2559.

19 Farnaud S，R.EvansLactoferrin-a multifunctional protein with antimicrobial properties［J］.Mol Immunol，2003;40(7):395-405.

20 H Wakabayashi，N Takakura，K Yamauchi et al.Modulation of immunity related gene expression in small intestines of mice by oral administration of lactoferrin［J］.Clin Vaccine Immunol，2006;13(2):239-245.

21 Suzuki Y A，Lonnerdal B.Characterization of mammalian receptors for lactoferrin［J］.Biochem Cell Biol，2002;80(1):75-80.

22 Haversen L，Ohlsson B G，Hahn-Zoric M et al.Lactoferrin downregulates the LPS-induced cytokine production in monocytic cells via NF-kappa B［J］.Cell Immunol，2002;220(2):83-95.

23 García-Montoya I A，Cendón T S，Arévalo-Gallegos et al.Lactoferrin a multiple bioactive protein:An overview［J］.Biochimica et Biophysica Acta，2012;1820(3):226-236.

24 Ann M.Muldera，Paul A.Connellana，Christopher J.Oliver et al.Bovine lactoferrin supplementation supports immune and antioxidant status in healthy human males［J］.Nutr Res，2008;28(9):583-589.

25 Zhang L F，Zheng S G，Yan Y G.Significances of anti-antibodies in autoimmune and virus hepatic disease［J］.Chin J Lab Diag，2008;12(6):745-748.

26 Bjornsson E，Talwalkar J，Treeprasertsuk S et al.Drug-inducedautoimmune hepatitis:clinical characteristics and prognosis［J］.Hepatology，2010;51(6):2040-2048.

27 Chrétiena P，Choustermanb M ，Abd Alsamad I et al.Non-organspecific autoantibodies in chronic hepatitis C patients:Association with histological activity and fibrosis［J］.J Autoimmun，2009;32(3-4):201-205.

28 Carlo Palazzia，Dan Buskilab，Salvatore D'Angelo et al.Autoantibodies in patients with chronic hepatitis C virus infection:pitfalls for the diagnosis of rheumatic diseases［J］.Autoimmun Rev，2012;11(9):659-663.