TLR5rs5744168基因多態性與廣西壯、漢族人系統性紅斑狼瘡的相關性研究①

吳飛云 林有坤 方 玲 袁志剛

(廣西醫科大學第一附屬醫院皮膚性病科，南寧530021)

系統性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus，SLE)是典型的系統性自身免疫病，一種以自身抗體產生和免疫復合物形成為特點的自身免疫性疾病，其中經研究發現天然免疫和獲得性免疫在該病發病和病程的發展中都起了重要作用［1］。有研究結果認為:SLE的易感性及臨床表型與遺傳因素密切相關。

Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)是一類跨膜受體，通過識別并結合相應病原相關分子模式(Pathogen associated molecular pattern，PAMP)，可啟動激活信號轉導途徑，并誘導某些免疫效應分子(包括炎性細胞因子)表達。目前對TLR的研究揭示該通路系統調節著天然免疫系統與獲得性免疫系統之間的平衡，TLRs對其配體的識別，不但啟動了天然免疫系統，而且也激活并調控了獲得性免疫系統，與免疫缺陷性疾病、異常免疫應答性疾病等疾病的發病有關［2-5］。

研究表明細菌鞭毛蛋白可以被人TLR5識別［6］。還有研究表明，TLR5的缺乏與防護非感染性炎癥有關［7］。對SLE遺傳學研究顯示共有50個左右基因位點與SLE有關，其中包括1q41-q42，這正好是TLR5基因所在位點［8］。Hawn等［9］在遺傳不平衡測試基礎上設計病例對照研究，對高加索包含199個病人和他們未患病的75名兄弟姐妹及326名父母的家系進行研究，發現TLR5基因的C1174T(rs5744168)單核苷酸多態性與防護SLE有關，推測TLR5基因+1174等位基因C是系統性紅斑狼瘡的危險因素，而等位基因T是系統性紅斑狼瘡的保護因素;但另一項針對美國高加索病人的研究則未能證實這一結論［10］。以上提示TLR5及其rs5744168位點基因多態性在SLE致病中可能起一定的作用，并且這種作用可能會有種族差異，但是否與廣西壯族SLE相關，并且在廣西壯族SLE和廣西漢族SLE之間是否有差異有待證實，本文將對此進行研究。

1 對象與方法

1.1 對象

1.1.1 研究對象 觀察組77例SLE患者為2010年5月至2011年8月廣西醫科大學第一附屬醫院皮膚性病科住院病人，所有觀察病例均具有典型的臨床疾病表現，均符合1997年美國風濕病學會制定的SLE診斷標準。對照組72例系我院健康體檢者，經病史、體檢及結合相關實驗室檢查排除1型糖尿病以及類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡等自身免疫病。所有研究對象對本研究知情同意，并簽有知情同意書，均為無親緣關系的壯族或漢族人，均為廣西籍人且三代內均為純壯族或漢族血統。觀察組和對照組構成如表1。

1.1.2 儀器和試劑 百泰克全血基因組DNA快速提取試劑盒(離心柱型);BioTeke，2×Power Taq PCR Master Mix;百泰克，DNA 50 bp Marker;TIANGEN 6×DNA電泳Loading Buffer;上海生工，溴化乙錠;德國 Biometru，Tpersonal PCR 儀。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 采集受檢者靜脈血2 ml，EDTA抗凝，百泰克全血基因組DNA快速提取試劑盒(離心柱型)提取白細胞基因組DNA，溶于洗脫緩沖液EB，－80℃保存。

1.2.2 引物設計 參照 GenBank中 TLR5 DNA序列primer5.0設計引物(序列見表2)，由上海生工生物工程技術公司合成。

表1 觀察組和對照組構成表Tab.1 Table of observation groups and control groups component

表2 TLR5 rs5744168基因引物序列Tab.2 TLR5 rs5744168 gene primer sequence

1.2.3 PCR擴增條件 PCR反應體系總體積50 μl，其中模板 DNA 6 μl，2 ×Power Taq PCR Master Mix 25 μl，上下游引物各 2 μl，用滅菌雙蒸水補足至 50 μl。PCR反應循環參數:95℃預變性3分鐘，95℃變性30秒，54℃的退火溫度復性30秒，72℃延伸45秒，40個循環，最后72℃延伸10分鐘。以上反應均在德國Biometru Tpersonal型的基因擴增儀上完成。

1.2.4 擴增產物直接序列測定 PCR擴增產物送上海英駿生物技術有限公司廣州分公司進行序列測定。

1.3 統計學處理 計算各組基因型和等位基因頻率，然后多態性位點基因型頻率和等位基因頻率比較采用SPSS13.0統計軟件進行卡方檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義。在病例組中按ds-DNA陽性與ds-DNA陰性、ANA陽性與ANA陰性、有無腎損害時TLR5rs5744168多態性位點的等位基因和基因型頻率分布情況，校正了性別、年齡等混雜因素后，用卡方檢驗分析TLR5rs5744168多態性與SLE臨床表現形式與實驗室檢查的相關性，以P＜0.05為具有統計學意義，使用SPSS13.0統計軟件進行統計分析。

2 結果

2.1 樣本DNA的提取結果 全血提取的DNA，均能跑出單一的亮的條帶，如圖1。

圖1 DNA電泳圖Fig.1 Agarose gel analysis of the extracted DNA

2.2 PCR產物電泳結果 DNA進行PCR后均能看到409 bp的亮的目的條帶，如圖2。

圖2 TLR5 rs5744168 PCR產物電泳圖Fig.2 The amplification results of TLR5 rs5744168 gene PCR products analyzed on agarose gel

2.3 PCR產物測序結果 擴增產物直接序列測定的結果，如圖3和圖4。

圖3 TLR5 rs5744168 C/C基因型擴增產物測序圖(下劃線為C等位基因)Fig.3 The sequencing fig of amplified products of TLR5 rs5744168C/C genotype(Underscore for the C allele)

圖4 TLR5 rs5744168 C/T基因型擴增產物測序圖(下劃線為T等位基因)Fig.4 The sequencing fig of amplified products of TLR5 rs5744168 C/T genotype(Underscore for the T allele)

2.4 統計分析結果

2.4.1 廣西壯族 SLE與漢族 SLE的TLR5 rs574 4168 C/T多態性的差異性分析 TLR5 rs5744168C/T基因型頻率以及相應的C、T等位基因頻率，在兩個觀察組間、兩個觀察組與相應對照組間的差異均沒有統計學意義(均P＞0.05)。見表3、4。

2.4.2 TLR5 rs5744168多態性位點與廣西SLE患者的臨床表現形式與實驗室檢查的關聯性分析 表5顯示了在病例組中按ds-DNA陽性與ds-DNA陰性、ANA陽性與 ANA陰性、有無腎損害時 TLR5 rs5744168多態性位點的等位基因頻率和基因型頻率分布情況。校正了性別、年齡等混雜因素后，用卡方檢驗分析顯示，TLR5rs5744168這一SNP位點與ds-DNA、ANA和有無腎損害的發生間均不存在差異性(P ＞0.05)。

表3 廣西壯、漢族SLE組TLR5 rs5744168基因型頻率及等位基因頻率分析對比Tab.3 The contrastive analysis of TLR5 rs5744168 genotype frequency and allele frequency in patients with SLE between Guangxi Zhuang nationality and Han nationality

表4 廣西壯、漢族SLE組與壯、漢族對照組TLR5 rs5744168基因型頻率及等位基因頻率分析對比Tab.4 The contrastive analysis of TLR5 rs5744168 genotype frequency and allele frequency between Guangxi Zhuang and Zhuang control groups and between Han SLE group and Han control groups

表5 TLR5 rs5744168的基因多態性與廣西SLE患者相關臨床表型、實驗室檢查的相關性分析Tab.5 The correlative analysis of TLR5 rs5744168 gene polymorphism and the related clinical phenotypes and laboratory examination of Guangxi patients with SLE

3 討論

目前SLE病因及發病機理尚未明確，致病因素可能有很多種，但是免疫遺傳因素在其發病中的作用已經得到學界的廣泛認同。在天然免疫中，宿主通過TLR5識別細菌的鞭毛蛋白(病原相關分子模式PAMPs)來介導免疫應答的產生及相關細胞因子的分泌。有研究表明，TLR5具有TLR同源域，可與CD4胞外區融合，造成TLR5組成性激活，進而激烈激活核轉錄因子 κB(Nuclear factor κB，NF-κB)，誘導腫瘤壞死因子 α(Tumour necrosis factor alpha，TNF-α)、白介素6(Interleukin 6，IL-6)、白介素8(IL-8)的分泌。TLR5屬于限制性Toll樣受體，主要表達于單核/巨噬細胞、未成熟樹突狀細胞(Dendritic cell，DC)和上皮細胞。而研究表明，DC與自身免疫性疾病的發生關系密切。

已知TLR5基因內存在多個能引起氨基酸發生改變的SNP位點，尤其是外顯子6中能導致無義突變的位點rs5744168，可引起TLR5的跨膜結構域和胞內部分的完全缺失，從而引起TLR5功能的喪失。Hawn等［9］發現TLR5 基因的C1174T(rs5744168)單核苷酸多態性與防護SLE有關，推測TLR5基因+1174等位基因C是SLE的危險因素，而等位基因T是SLE的保護因素。而Demirci［10］研究表明 TLR5基因rs5744168的基因多態性與SLE的危險性或保護性并不存在關聯性。由此我們推測，TLR5的遺傳變異很可能會影響SLE的發生風險和病程進展，并存在種族差異。

我們采用聚合酶鏈反應和直接測序法對33例壯族、44例漢族SLE患者和72名壯漢族健康對照者進行檢測，結果發現TLR5 rs5744168 C/T基因型頻率和等位基因頻率均與廣西地區的壯、漢族SLE的發生風險或保護性無關，也不存在民族間的差異性，與 Demirci［10］和 Sanchez［11］等的研究結果相吻合，但是與Hawn［9］等的研究結果相反。我們還發現TLR5 rs5744168這一SNP位點與廣西SLE是否ds-DNA陽性、ANA陽性和有無腎損害的發生間亦均不存在相關性，提示該位點與本區域內SLE疾病進展可能沒有相關性。但此結果不能排除與觀察的病例數偏少有關，因此TLR5基因多態性與廣西壯漢族SLE易感性間的確切關聯還有待進一步研究。

1 Rahman A H，Eisenberg R A.The role of toll-like receptors in systemic lupis erythematosus［J］.Springer Semin Immunopathol，2006;28(2):131-143.

2 Ichikawa H T，Williams L P，Sehal B M.Activation of APCs through CD40 or Toll-like receptor overcomes tolerance and precipitates autoimmune disease［J］.Immunol，2002;169(5):2781-2787.

3 Haggqvist B，Hultman P.Effects of deviating the thresponse in murine mercury induced autoimmunity towards a thresponse［J］.Clin Exp Immunol，2003;134(2):202-209.

4 Field A C，Bloch M F，Bellon B.Neonatal tolerance to a thmediated autoimmune disease generates CD8+Tc1 regulatory cells［J］.Autoimmun，2003;21(3):201-212.

5 Krieg A M.CpG DNA:a pathogenic factor in systemic lupis erythematosus［J］.J Clin Immunol，1995;15(6):284-292.

6 Hayashi F，Smith K D，Ozinsky A et al.The innate immune response to bacterial flagellin is mediated by Toll-like receptor 5［J］.Nature ，2001;410(6832):1099-1103.

7 Wakeland E K，Liu K，Graham R R et al.Delineating the genetic basis of systemic lupus erythematosus［J］.Immunity，2001;15(3):397-408.

8 Graham R R，Langefeld C D，Gaffney P M et al.Genetic linkage and transmission disequilibrium of marker haplotypes at chromosome 1q41 in human systemic lupus erythematosus［J］.Arthritis Res，2001;3(5):299-305.

9 Hawn T R，Wu H，Grossman J M et al.A stop codon polymorphism of Toll-like receptor 5 is associated with resistance to systemic lupus erythematosus［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2005;102(30):10593-10597.

10 Demirci F Y，Manzi S，Ramsey-Goldman R et al.Association study of Toll-like receptor 5(TLR5)and Toll-like receptor 9(TLR9)polymorphisms in systemic lupus erythematosus［J］.J Rheumatol，2007;34(8):1708-1711.

11 Sanchez E，Callejas-Rubio J L，Sabio J M et al.Investigation of TLR5 and TLR7 as candidate genes for susceptibility to systemic lupus erythematosus［J］.Clin Exp Rheumatol，2009;27(2):267-271.