內源性一氧化氮在急性高原病中的研究進展*

卞士柱， 黃 嵐

1 一氧化氮(nitric oxide，NO)與內源性一氧化氮(endogenous NO，eNO)

NO是具有調節血管張力、血流等眾多生物學作用的脂溶性氣體信號分子，eNO是由L－精氨酸(L－arginine，L－Arg)經過體內一氧化氮合酶［nitric oxide synthase，NOS;主要有神經源型(neuronal NOS，nNOS)、誘導型(inducible NOS，iNOS)和內皮源型(endothelial NOS，eNOS)3種］催化合成的，廣泛存在于全身組織［1］。NO通過一些生物分子和細胞間相互作用參與機體的保護、調節及逆轉等生理過程［2］。近年來的研究發現NO在調節血管張力、抑制炎癥以及抗動脈粥樣硬化中發揮關鍵作用［1－2］。

2 急性高原病

急性高原病(acute mountain sickness，AMS)包括急性輕癥高原病(acute mild altitude disease，AMAD)和急性重癥高原病［分為高原肺水腫(high altitude pulmonary edema，HAPE)和高原腦水腫(high altitude cerebral edema，HACE)］，通常發生于由平原快速進入高原(2 500 m以上)或由較低海拔高原快速到達更高海拔的人群，發病率和病死率均較高［3］。AMAD是高原暴露引起的各系統暫時性功能紊亂，主要表現為頭痛、睡眠障礙、惡心、嘔吐、納差、胸悶等。HAPE的發生與缺氧性肺動脈高壓、肺血容量增加、肺血管內凝血、肺毛細血管通透性增強等有關。而HACE是由于在急性缺氧條件下，腦毛細血管和腦細胞膜通透性增加，致使血漿內的膠體物質、離子、水分向血管外和細胞內移動，同時無氧代謝增強，ATP(adenosine triphosphate)形成減少，細胞膜鈉泵癱瘓以及酸中毒的發生，使鈉和水進入細胞內，導致腦細胞水腫以及血管靜水壓發生變化［4］。

目前AMS的確切機制仍未清楚，主要是高原低壓、低氧以及寒冷氣候引起應激狀態，機體不能有效適應環境變化(AMS也稱為高原適應不全)。而且AMS病理生理過程涉及:低氧對呼吸驅動，血液循環、血壓的變化以及低氧對血管、腦等組織細胞的損傷作用等眾多因素。近年來研究發現NO在AMS發病過程中對血管反應性、血管穩態的維持具有重要作用。

3 eNO水平隨高原低氧條件變化

eNO生成過程需要氧的參與，在高原缺氧條件下，體內NO的生成降低［5］，與此相一致，另有研究發現低氧使 NO 水平降低［6］。Brown 等［7］發現4 200 m暴露3 h后，呼出氣體NO分壓降低 。2011年的一項研究結果:進入海拔3 440 m后，人唾液、血清和尿液中NO水平降低，再往高海拔上升時，唾液和尿液中NO水平進一步下降，但是血清NO維持不變，相反，細胞內 NO反而增加［8］，可能是由于細胞應激導致NO合成增加而釋放受阻。但是在高原世居人群中呼出NO水平卻比平原世居者高，說明eNO與 AMS 的發生、高原適應相關［9］。Schneider等［10］采用輸入L－Arg的方法研究發現，高原低氧可能通過破壞NOS或降低L－Arg利用度而導致NO合成、釋放受阻。

4 eNO水平在世居高原與新到高原訪問健康人群間的不同

對于高原世居人群(如西藏人)由于長期慢性低氧，肺、血漿以及紅細胞NO水平至少是其他人群的2倍甚至很多倍。紅細胞相關的氮氧化合物比其他人高200倍。其他高原居住人群，NO水平雖然沒有西藏人那么高，但是仍高出低海拔人群［11］。高原世居人群循環氮氧化合物同樣遠遠高于平原居住人群。

有人通過低氧艙的模擬研究發現急性高原暴露呼出NO水平增加［12］，但是另外一項研究發現，高原肺水腫患者呼出NO氣體水平低于其健康對照組基線水平至少2個標準差。平原健康人群新到高原，肺中、血漿以及紅細胞中NO水平在2 h內下降，然后在48 h內恢復正常或者稍微升高，5 d后增加高于基線水平［11］。也有人發現可能是由于星形膠質細胞的水腫，NO和硝酸鹽(NO代謝產物)的生成增加［13－14］。

關于高原暴露時eNO水平仍有爭論，有人發現急性高原暴露呼出NO水平增加，可能與研究對象被采集標本時已經在高原暴露的時間長短有關。也有人發現可能是由于星形膠質細胞水腫，NO和硝酸鹽(NO代謝產物)生成增加［14］。但是可以肯定的一點是eNO在急性高原暴露時的變化參與AMS的發病過程。

5 eNO與AMS病理生理

NO是體內重要的血管活性物質之一;具有舒張血管、增加組織灌注的功能。大量證據表明NO可能在AMS發生、發展中發揮重要的作用。最近的研究發現S－亞硝基血紅蛋白(NO與血紅蛋白相互作用的代謝產物)隨著海拔高度上升而增加，極大影響了NO的壽命，從而對AMS的發生和發展創造了條件［8］。

5.1 eNO與肺動脈壓及HAPE 低氧誘導的肺動脈收縮及其后續效應是發展成為HAPE的基本過程。NO降低肺血管的缺氧收縮，增加氣體交換，降低肺毛細血管應激衰竭從而對低氧環境進行代償。

對47名無吸煙史、成年健康平原世居者呼出NO、血氧飽和度以及心率與AMS癥狀相關性的研究結果顯示:呼出NO分壓由平原到2 800和4 200 m均顯著降低，回到平原后NO呼出水平也返回原來值［7］。然而 Brown等［7］的研究并未證實呼出氣 NO水平與AMS具有相關性。可能是由于上述研究的受試者缺氧時間短、樣本量小的緣故。大量研究發現急進高原NO變化與高原肺動脈高壓及肺血管穩態失衡相關。

低氧體內外實驗證實，L－單甲基精氨酸抑制NO合成，增加肺動脈壓絕對值和肺血管阻力。Bailey等［15］對26名志愿者的研究發現，進入高原后肺動脈收縮壓力(pulmonary arterial systolic pressure，PASP)增加與自由基、NO生物代謝產物的跨肺凈輸出量相關。急性高原暴露引起肺內輸出自由基減少，NO生物利用度降低，從而引發肺動脈收縮和肺動脈高壓，進而產生右心功能不全、體液潴留、肺動脈高壓甚至HAPE。

另有對19名健康男性志愿者常壓低氧下暴露6 h的研究，發現患AMS組呼出NO水平顯著低于未患AMS組，但是二者均高于基線水平［12］，可能是由于在AMS組低氧誘導的NO增高水平不足以代償并及時調整血管張力和體液的穩態失衡。

低氧引起的肺血管收縮是機體自身對肺泡低氧的保護適應性反應，以求使通氣/血流比趨于正常。HAPE易感者在平原或高原呼出NO均較低［16］。低氧時，肺動脈收縮壓變化與下呼吸道NO排泄分數相關，提示呼吸道生成NO的減少可能是HAPE的一個發病原因［17］。

5.2 eNO與腦血管變化及HACE 急進高原，低氧和低碳酸血癥增加腦血流量，導致腦血流剪切力增加，代償性增加NO生成。與其它在動物模型或人體上的研究一致，Ainslie等［18］發現腦對高碳酸血癥的應答增加NO的產生，介導腦血管擴張，產生腦部高灌注而引起頭痛，甚至腦血管靜水壓增加而發生血管源性水腫(HACE)。

由于高原低壓低氧的影響，腦的有氧代謝與自由基的產生發生變化，對AMS患者腦內自由基變化與腦血流自我調節、血腦屏障功能的研究顯示:低氧過程中總NO在整體趨勢是降低的，血漿和紅細胞NO代謝庫在AMS+組中較低，AMS與體內氧化還原反應的平衡改變破壞相關［19］。通過檢測腦內NO代謝產物評價AMS危險因素發現:低氧降低脂類衍生物(如烷氧基)、自由基和過氧化氫脂質在腦的凈輸出量和動脈－靜脈間濃度差(a－vD)與高原頭痛(high altitude headache，HAH)及AMS相關。同時低氧刺激氧化－硝酸基(與NO生物合成、代謝相關)應激，與人類其它低氧血癥疾病模型有廣泛聯系，這可能是一種獨立于血腦屏障(blood brain barrier，BBB)功能障礙、腦氧化代謝紊亂的AMS危險因素［20］。

根據AMS國際診斷標準(Lake Louise Scoring System，LLS)，HAH是AMS的基礎癥狀，有人認為HAH可能是由于NO激活了三叉神經血管系統。腦膜動脈以及腦動脈存在eNOS，nNOS存在于中樞神經系統并與小動脈有密切聯系，可能具有擴張血管的作用，在三叉神經節中nNOS與降鈣素基因相關肽(calcitonin gene－related peptide，CGRP)共存于少數神經細胞中，可能在擴張顱內外血管中發揮重要作用，增加了HAH/AMS的發生［21］。腦組織低氧會導致NO介導的血管張力改變與AMS相關［22］的觀點已被后續眾多研究所逐步證實。

6 NOS基因多態性與AMS易感性

盡管急進高原后AMS的發病率非常高，但是個體間發病存在明顯差異，與遺傳因素有關。目前發現血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的基因(VEGF)、缺氧誘導因子(hypoxia －inducible factor，HIF)的基因(HIF)以及 eNOS等基因的多態性與AMS發病相關。

eNO主要來源之一是 eNOS。eNOS基因位于7q35～36，長約21 kb，有26個外顯子和25個內含子，其mRNA約4.1 kb，編碼含1 203氨基酸殘基多肽。eNOS基因多態性改變eNOS活性從而影響NO生成。目前對eNOS單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms，SNP)和串聯重復序列(variable number of tandem repeat，VNTR)的基因多態性研究較多。有研究證實eNOS基因多態性與高原習服、適應相關，但是eNOS基因多態性在AMS發病中的作用結論不一。

eNOS基因缺失小鼠暴露于輕度缺氧下即可快速發生肺動脈高壓，提示eNOS基因缺陷與HAPE易感性有關。之前在高危人群中的基因相關性研究提示，eNOS基因多態性可能與HAPE相關;在尼泊爾人群中篩選出eNOS基因的7個SNP位點。其中rs1799983標簽SNP導致了298位1個氨基酸的置換［谷氨酸(glutamine，Glu)變為天冬氨酸(asparagine，Asp)］，其基因型在AMS組和對照組中顯著不同，另外6個SNP在等位基因和基因型的頻率上組間差異不明顯［23］。

在日本的一項研究顯示，eNOS的rs1799983和27－bp VNTR基因多態性與HAPE易感性強相關，表明上述2種多態性與NO合成、代謝相關［24］。但是有人檢測了高加索人2個eNOS基因多態性:G894T(鳥嘌呤，guanine，G;胸腺嘧啶，thymine，T)SNP(標簽rs1799983)和串聯重復序列(27－bp VNTR)，發現:雖然急進入高原后肺動脈壓升高顯著，但是eNOS基因多態性各組人群中肺動脈平均壓力無明顯差異，提示G894T和27－bp VNTR與平原或高原上肺動脈壓力無相關性［25］。最新的研究亦未證實上述相關性，可能是由于T894T基因型能短暫消除急性高原暴露時肺動脈收縮，阻止了肺動脈高原及HAPE的發生［16］。也有研究證實eNOS另 2個SNP位點(rs743507和rs1800779)與AMS沒有相關性［26］。結果可能受基因頻率過低，且樣本量太小等因素影響。

雖然G894T變異是保守的，但是含有Asp298的eNOS只有含 Glu298的 eNOS活性的 50%。Wang等［27］發現:高水平的NO與高原習服、適應相關。但是另有人證實了T894等位基因在HAPE易感患者中顯著較高，相反G894等位基因在高原人群中更常見，可能是該基因變異增加了NO水平，促進高原習服和適應［5］。T894等位基因在 AMS組中頻率高于未患AMS組，提示eNOS基因多態性在AMS易感性中具有重要作用，研究也表明僅僅T894等位基因的存在不足以引起AMS的發生，T894等位基因可能與其它一些因素作用加重已經存在的內皮功能損傷。G=T、T=T聯合基因型更常見于AMS組。由此可以推測:eNOS基因多態性可能與AMS的危險因素或保護因素相關，需要進一步深入研究。

7 NO及其前體物質治療AMS

綜上所述，eNO在調節肺腦血管、促進高原習服與適應中發揮重要作用，那么是否可以應用外源性NO或增加eNO生成來防治AMS呢?盡管目前還沒有正式預防和治療AMS的NO藥物上市，但是已經有人進行了一些試驗性治療，并且取得一些成效。

7.1 直接應用NO治療AMS 在海拔3 658 m處隨機對照的研究中，常規治療組(吸氧、氨茶堿、地塞米松以及呋塞米)和NO治療組(僅僅吸入空氣平衡的0.001%NO)的結果表明，血清內皮素(endothelin，ET)、ET/NO和LLS評分在應用NO治療后均降低。這說明NO可能通過改變血管活動因子改善AMS癥狀。另外，吸入NO顯著降低HAPE易感人群肺動脈壓力，可能成為AMS的有效治療方法，較常規治療方法有獨特的優勢［28］。

AMS發生涉及低壓低氧引起炎癥過程。已經證實給予低濃度NO通過對粒細胞、內皮細胞、淋巴細胞和巨噬細胞的抑制而達到抑制IL－8的分泌，拮抗急性高原病相關的炎癥，對AMS患者的康復有著積極的作用［29］。

AMS患者在NO治療后，血漿ET、神經肽Y及LLS評分均顯著降低，說明NO通過對AMS患者血管舒縮性、腦細胞、心功能的調節而改善其癥狀。而CGRP在NO治療后顯著升高，且治療前血清NO與血漿ET呈顯著負相關，與血漿CGRP呈顯著的正相關，體現了NO通過對血管穩態調節而消除AMS癥狀［30］。

7.2 應用NO前體物質L－Arg增加eNO和改善AMS 雖然使用外源性NO供體的副作用是頭痛，但是高原上應用NO前體L－Arg可以提高血氧飽和度，并能改善AMS的癥狀［10］。高原低氧可能降低了eNOS的底物L－Arg而抑制NO的生成，補充LArg，能改善 eNO。

4 342 m海拔食物添加L－Arg實驗發現:LArg對整體LLS評分沒有顯著影響，L－Arg處理12 h組中頭痛、呼出NO、呼吸凝集物VEGF均顯著增加，但促紅細胞生成素變化不大，表明L－Arg的供給可能通過NO依賴的途徑穩定肺內HIF。但是對AMS的預防效果不顯著［31］，可能是因為L－Arg經腸道吸收后結構遭到破壞。

常氧下30 min和低氧暴露(4 350 m)36 h后應用L－Arg，結果顯示，注射L－Arg后15～45 min血氧飽和度持續增加，L－Arg治療的AMS+的LLS評分輕度減少，表明低氧導致eNOS的破壞或L－Arg的生物利用度降低，L－Arg的應用可能通過增加通氣/血流比提高血氧飽和度，從而達到治療AMS的目的。所有上述結果與低氧導致eNO生成減少一致，同時這種降低可被NOS協同底物的供給而阻斷［10］

8 展望

盡管AMS的病理生理機制未完全清楚，對AMS防治研究結果不一，但是隨著對AMS認識的加深，將進一步推動對AMS發生機制及防治的研究，鑒于眾多證據表明NO在AMS中的重要作用，今后對NO、NOS以及NOS基因在AMS病理生理過程、預防和治療中的作用研究將有望改善目前AMS(尤其是HACE和HAPE)的診治現狀。

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