人臍靜脈內皮細胞在糖尿病血管并發癥研究中的應用進展

楊 芳 李強翔 (南華大學附屬婁底市中心醫院，湖南 婁底 47000)

人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)是一種干細胞，一般取自健康正常分娩或剖宮產孕婦的臍靜脈，再用胰酶消化法分離培養。因為其能無限次傳代(理論上)，易于實驗操作，近年來經常用于各種糖尿病血管并發癥實驗的研究。

1 糖尿病血管內皮細胞損傷的發生機制

1.1 高糖引起HUVECs損傷中的發生機制

1.1.1 高濃度葡萄糖對HUVECs活力和黏附分子表達的影響研究發現〔1〕，用高濃度葡萄糖培養HUVECs，其白細胞黏附分子的表達可增加，并可誘導內皮細胞和單核細胞黏附。且蛋白激酶C途徑是高糖誘導的血管細胞黏附分子(VCAM-1)、細胞間黏附分子(ICAM-1)表達增加最直接有效的途徑。所以抑制以上途徑有可能減少動脈粥樣硬化的發生。我們可以認為，如果使用新的或現有的治療糖尿病的藥物降低血糖的同時并可減少ICAM-1、VCAM-1表達增加的藥物，也許對減少糖尿病患者慢性并發癥的發生率是條有益的途徑〔2〕。

1.1.2 高糖對HUVECs血管內皮生長因子(VEGF)mRNA表達的影響 VEGF又稱為血管通透性因子。目前已知的，視網膜的全層和腎臟的大部分組織分布有血管內皮生長因子及其受體。研究發現，VEGF在高糖條件下可通過作用于視網膜血管內皮細胞上的大量高親和力受體，來促進血管內皮細分裂和增殖，并可導致視網膜新生血管形成。另有學者認為，VEGF的表達可能參與糖尿病一視網膜屏障的破壞。且有實驗數據顯示〔3〕，人臍靜脈內皮細胞VEGF mRNA的表達可伴隨高糖濃度的增加而逐漸增加，在22 mmol/L達到最高峰，從44 mmol/L時下降;且在22 mmol/L葡萄糖的持續作用下，隨著作用時間的延長，VEGF水平逐漸升高;而當作用72 h時VEGF mRNA水平卻不再增加。因此，研究表明〔4〕，高血糖其本身可引起 HUVECs的VEGF mRNA表達的增加，并且在一定范圍內呈時間和劑量依賴性。

1.1.3 高糖對HUVECs凋亡的影響 內皮細胞凋亡是糖尿病患者血管并發癥發生的始發因素〔5〕。

1.1.3.1 eNOS表達減弱可以增加內皮細胞凋亡的發生 體外實驗研究發現，在高糖的影響下，可促使線粒體呼吸鏈中氧自由基生成增加，并使舒血管物質一氧化氮(NO)利用率下降，核因子-κB(NF-κB)活性降低，和縮血管物質內皮素的生成增多，引起內皮依賴的血管舒張功能缺陷，繼而導致糖尿病患者微血管和大血管并發癥的發生。且研究觀察到，用高濃度葡萄糖和甘露醇分別誘導HUVEC內皮微粒(EMPs)的釋放，前者其EMPs的釋放水平與細胞凋亡率呈正相關;而后者與細胞凋亡率則無顯著性差異。該結果提示，細胞內皮微粒的釋放水平的改變與高糖本身或其反應產物有關，其更進一步導致細胞損傷。在高糖影響下，HUVEC的凋亡以及功能障礙與許多因素有關，調節機制比較復雜。而內皮細胞的功能狀態決定其釋放的EMPs的水平與性質。因此，EMPs在今后心血管領域等方面的研究主要集中在其促凝、促炎反應，及其加重內皮功能障礙和促進血管生成的作用〔6〕。血管內皮細胞(EC)的凋亡是糖尿病大血管病變的最初的啟動因素，一系列血管結構和功能的改變都與之有關，并且最終可引起動脈硬化〔7〕。血管內皮結構的損害及其在調控血管張力、血管通透性、血流、凝血及血栓溶解上的作用的削弱均與內皮細胞凋亡增加有關，并且最終可誘發血管病變的發生。內皮型一氧化碳合酶(eNOS)是血管內皮細胞產生NO的主要限速酶。一般情況下，內皮細胞釋放的NO可以起到重要的血管保護作用。研究已經證實HUVEC表達eNOS的改變與C肽有關。且進一步發現，高糖可以引起eNOS的表達減弱，且與細胞凋亡呈負相關。即eNOS表達減弱可以增加內皮細胞凋亡的發生，提示可通過調節eNOS途徑，抑制細胞凋亡，來發揮糖尿病的血管保護作用〔8〕。

1.1.3.2 Wnt信號通路抑制和抑制FKN蛋白表達上調可導致內皮細胞凋亡 有研究〔9〕探討高糖誘導的HUVECs的CX3C類趨化因子fractalkine(FKN)表達與細胞凋亡的可能機制。用對數生長期的HUVECs，分為正常組(N)、高糖組(HG)、氯化鋰(LiCl)組、高糖+LiCl組(HG+LiCl)。用低糖(如5.5 mmol/L)DMEM培養的HUVECs種板10 h后按以上分組分別加入10 mmol/L的LiCl預處理2 h，再用高糖(如33.3 mmol/L)干預48 h，用免疫組化 SABC法檢測 β-catenin及 p-GSK-3β(Ser9)，TUNEL法檢測細胞凋亡，免疫熒光FITC法檢測FKN蛋白水平變化，RT-PCR檢測GSK-3β和FKN mRNA水平變化。結果顯示:①與正常組比較，高糖誘導的HUVECs凋亡率明顯增加。與高糖組比較，LiCl可明顯降低高糖環境下HUVECs的凋亡率，但仍高于正常組。②與正常組比較，高糖組HUVECs的多功能的蛋白質β-catenin及磷酸化糖原合成酶激酶 p-GSK-3β(Ser9)蛋白表達降低;GSK-3βmRNA水平及FKN蛋白和mRNA水平升高。③與高糖組比較，LiCl+高糖組HUVECsβ-catenin及p-GSK-3β(Ser9)蛋白表達升高，GSK-3βmRNA水平及 FKN蛋白和mRNA水平降低。因此，Wnt信號通路的激活是由于激動劑LiCl通過抑制GSK-3β活性等一系列級聯反應促進βcatenin入核而激活下游轉錄因子來起作用的。該研究揭示了高糖可誘導趨化因子FKN表達且能被LiCl部分抑制，是其抑制HUVECs的經典 Wnt信號通路，并發現，高糖誘導的 HUVECs凋亡也可被LiCl部分抑制，提示高糖誘導的FKN表達和HUVECs凋亡可能與Wnt信號通路有關。由此，在以后糖尿病的治療中我們可以著重研究適當激活Wnt信號通路或者抑制FKN表達而降低血管ECs凋亡和抑制炎癥反應方面的作用。

1.1.3.3 球狀脂聯素抑制波動性高血糖誘導HUVECs凋亡有實驗〔10〕探討球狀脂聯素在抑制波動性高血糖誘導HUVECs凋亡中的機制。在不同條件下體外培養HUVECs 5 d。實驗分為對照組、高糖組、葡萄糖交替組(每8 h更換培養液一次)、高滲組(甘露醇)和高滲交替組。葡萄糖交替組中部分細胞用不同濃度球狀脂聯素干預，用脂聯素受體1特異性小干擾RNA作用內皮細胞。采用流式細胞儀檢測細胞凋亡及RT-PCR檢測脂聯素受體1和受體2的mRNA表達。結果與對照組比較，高糖組和葡萄糖交替組細胞凋亡明顯增加，脂聯素受體1 mRNA的表達顯著降低。與高糖組比較，葡萄糖交替組細胞凋亡顯著增加，脂聯素受體1 mRNA的表達顯著降低。不同濃度球狀脂聯素作用內皮細胞，發現3 mg/L球狀脂聯素能顯著抑制內皮細胞凋亡，并能顯著拮抗波動性高血糖誘導的脂聯素受體1 mRNA表達的下降。不同組間內皮細胞脂聯素受體2 mRNA表達差異無顯著性。siRNA作用內皮細胞后球狀脂聯素這種抑制凋亡作用顯著減弱。結果示:與持續性高血糖條件比較，波動性高血糖顯著降低HUVECs脂聯素受體1 mRNA的表達，而對脂聯素受體2 mRNA的表達無影響。因此，球狀脂聯素可能通過脂聯素受體1拮抗波動性高血糖誘導的HUVECs凋亡。

1.1.3.4 高糖對HUVEC的c-Jun基因表達的影響 c-Jun基因是細胞內的一種原癌基因，其表達產物Jun與Fos形成異源二聚體，即有活性的轉錄因子AP-1，可以通過對靶基因調節，參與多種細胞增殖、凋亡的過程。有實驗〔11〕將HUVEC體外培養至第3代，然后分別用不同濃度葡萄糖培養液培養HUVEC，并將高滲甘露醇培養液培養者設為對照組。以一定濃度葡萄糖(如22.0 mmol/L)分別作用不同時間，應用RT-PCR和免疫細胞化學方法檢測c-Jun mRNA和蛋白表達水平。結果顯示，高糖以濃度依賴方式上調HUVEC的c-Jun mRNA的表達，高濃度葡萄糖達到最強刺激效應，與低濃度葡萄糖組及對照組比較差異均有統計學意義。其中22.0 mmol/L葡萄糖刺激0.5 h c-Jun的mRNA表達升高，刺激1.0 h達高峰，2.0 h開始下降。22.0 mmol/L葡萄糖刺激2 h后，人臍靜脈內皮c-Jun蛋白表達增加。因此，高糖可上調HUVECs c-Jun mRNA和蛋白表達。

總之，HUVECs凋亡的基因表達和調節機制非常復雜，高糖對其的影響因素也很多，其細胞生物學機制還有待于我們繼續探討和研究。

1.2 2型糖尿病患者低密度脂蛋白對HUVECs損傷 糖尿病的高血糖狀態是由于氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)引起的潛在的氧化損傷以及氧化應激的增加引起的。當低密度脂蛋白(LDL)顆粒在血管壁處吸收并氧化，可以促進泡沫細胞的形成，遏制eNOS的產生，從而最終導致動脈粥樣硬化(AS)的形成。2型糖尿病患者的AS發生率明顯比正常人高，其血管并發癥的啟動因素可能與血管內皮功能下降有關。NO是血管內皮細胞生成的多種生物活性因子中主要的舒血管物質。內皮功能障礙主要表現為NO的生理活性下降〔12〕，且AS發生發展中一個重要的因素是NO生理活性的下降。許多研究發現〔13〕，AS的形成與LDL的氧化修飾有關。有研究〔14〕將正常人LDL(nLDL)、糖尿病患者LDL(dLDL)、人工氧化的LDL(ox.LDL)分為三組，并以人工氧化的LDL作為損傷陽性對照，分別與內皮細胞孵育一段時間后，觀察上清液中NO與丙二醛的變化，來探討dLDL損傷內皮細胞的機制，尤其是對時間效應的影響，研究2型糖尿病血管并發癥的發生發展的過程，為2型糖尿病患者的臨床治療及康復干預提供了重要的理論依據。

1.3 游離脂肪酸對HUVECs的影響和作用 有研究發現〔15〕，游離脂肪酸(FFA)可引起靜脈內皮細胞(VEC)功能損傷。此研究是用生理濃度的軟脂酸培養HUVEC，觀察到隨著時間的延長，細胞死亡數逐漸增加。且有研究〔16〕在相同條件下，觀察了葡萄糖對HUVEC的細胞生存狀況的影響，發現HUVEC在較高濃度的葡萄糖狀態下，且當作用時間延長時，細胞仍未出現明顯的毒害作用或死亡。結果提示軟脂酸對VEC有較強的毒性作用;而葡萄糖對HUVEC的毒性作用遠遠小于FFA，或者說葡萄糖對HUVEC的損傷作用可能在功能水平而不是在細胞的生存水平;同時推測葡萄糖對HUVEC的毒性作用是一個長期的、慢性的過程，短時間內并不能反映其傷害作用和程度。并且將葡萄糖與軟脂酸共同作用于細胞時，細胞死亡數目較軟脂酸單獨作用時增多，其細胞死亡率隨著葡萄糖濃度的增加而增加，提示軟脂酸對HUVEC的毒性作用在高糖狀況下可加重。我們可以由此推測:當軟脂酸和葡萄糖共同培養細胞時，細胞死亡率增加可能是因為葡萄糖雖然沒有引起細胞死亡但可造成細胞功能損傷，而有功能缺陷的細胞在軟脂酸的毒性作用下，細胞死亡加速，其損傷程度大大增加。因此在臨床上我們看到很多糖尿病患者伴有高FFA血癥時比單純的高FFA血癥的患者相對其大血管并發癥的發生率要高得多。而將高濃度的胰島素與軟脂酸兩者共同作用于細胞或將胰島素、葡萄糖和軟脂酸三者共同作用于細胞時，發活率比軟脂酸單獨作用組明顯增加，而細胞的死亡率較葡萄糖與軟脂酸共同作用時明顯減少，進一步提示胰島素本身對HUVEC不但沒有毒性作用，反而還有保護作用。在實驗中用流式細胞儀檢測細胞凋亡率，結果顯示，生理濃度的軟脂酸短時間內作用于細胞時，細胞就表現為凋亡，再延長作用時間或加大軟脂酸濃度時，細胞表現為死亡;而高濃度葡萄糖作用于HUVEC較長一段時間后，細胞方出現凋亡，延長作用時間時只是細胞的凋亡數增多。說明葡萄糖、軟脂酸對HUVEC造成的損傷其程度和機理并不相同，由此可推測，FFA毒性比葡萄糖大，短時間內就可引起細胞的DNA嚴重損傷而死亡，而葡萄糖只是擾亂了DNA的功能，故對細胞的損害只是表現為凋亡。所以，研究結果〔17〕表明FFA和葡萄糖均可引起HUVEC損傷，但FFA比葡萄糖對HUVEC的毒性作用遠遠要大，FFA可直接損傷細胞，且高糖狀況下會加重FFA對HUVEC的損傷，胰島素本身對HUVEC有保護作用，HUVEC的損傷并不是高濃度的胰島素引起的;葡萄糖對HUVEC的損傷機制主要是引起細胞凋亡為主，而FFA是以引起細胞死亡為主。

2 某些抗氧化劑對糖尿病引起的HUVEC損傷的保護作用

人體內許多的生物化學反應與高血糖有關，在高糖狀況下氧自由基(OFR)產生增加，所以，糖尿病時患者氧化應激增加，抗氧化劑可以減輕細胞脂質過氧化，不但能夠減輕高血糖對血管內皮細胞的損害，而且還可以保護血管內皮細胞〔18〕。

2.1 N-乙酰半胱氨酸對波動性糖環境下臍靜脈內皮細胞損傷的保護作用 N-乙酰半胱氨酸(NAC)是一種抗氧化劑，可以減少體內自由基生成和清除細胞已生成的自由基。實驗證實，NAC是通過抑制內皮細胞的脂質過氧化反應，來降低引起內皮細胞損傷的過氧化脂質(LPO)的含量的。其可能是通過阻斷OFR連鎖反應，避免生物膜磷脂中的不飽和脂肪酸受氧化，保護細胞膜上蛋白質的空間構型不受改變，來減少內皮細胞內大量LPO的生成和蓄積，從而阻止了不飽和脂肪酸過氧化對的膜結構和功能的損傷，維護細胞的穩定。有文獻報道〔19〕，高糖狀況會抑制血管內皮細胞的增殖，其增殖指數下降。在細胞增殖過程中存在多個監控系統，當其探測到損傷時，就會終止細胞增殖進展，使細胞周期停留在周期進程中的2個限制點，G/S或G/M轉變期。本研究示，在高糖或波動性糖影響下，使細胞被阻滯于G/S轉變期，細胞增殖受抑制;若實驗前加入NAC，則S期細胞增殖的百分率顯著升高，G期細胞增殖的百分率降低，提示高糖及波動性糖對內皮細胞增殖的抑制作用能被NAC減輕。綜上，NAC可降低細胞內脂質過氧化作用，發揮對過氧化脂質所致血管內皮細胞損傷的保護作用。因此，我們以后在動脈粥樣硬化及糖尿病等疾病所伴隨的血管內皮功能失調方面的防治方面可以重點研究NAC在血管內皮上所具有的抗氧化活性作用〔20〕。

2.2 中藥大黃素對糖尿病血管內皮損傷的保護作用 大黃素是一種羥基蒽醌的衍生物，主要從大黃的根莖等中藥中提取獲得。大黃素在清除自由基、抗纖維化、抑菌、抗炎、抗腫瘤等方面具有顯著的作用〔21～24〕。早有報道〔25〕證實，在 NF-κB 信號轉導途徑中干擾素α(TNF-α)誘導的人臍靜脈內皮細胞中黏附分子VCAM-1，ICAM-1和E-selectin的表達的抑制與大黃素有關。Li等研究也發現大黃素對體外脂多糖(lipopolysac charide，LPS)誘導的巨噬細胞炎癥反應具有明顯的抑制作用，其可以抑制白血病介素IL-10及TNF-α的表達，以及NF-κB的活化。為了研究大黃素在血管內皮方面的抗血管炎癥反應的作用，有實驗〔26〕以LPS誘導的HUVECs炎性反應為研究模型，用大黃素與血管內皮細胞共同培養后，發現LPS誘導的內皮細胞中NF-κB的活化和IκB的降解均減少，提示大黃素能夠通過抑制以上反應來抑制內皮細胞中促炎因子IL-1β和趨化因子的表達。但是大黃素沒有對IL-1β誘導的血管內細胞中NF-κB的活化和IκB的降解產生抑制作用，說明大黃素的作用靶點可能位于LPS受體復合物部位，而不是位于LPS和IL-1β所共同的信號轉導途徑中。綜上，大黃素抑制LPS誘導的血管內皮細胞炎性反應的活性提示，其可能在防治動脈粥樣硬化或與炎癥相關的心血管疾病方面具有應用前景。

綜上所述，內皮細胞損傷是糖尿病血管病變的最初的啟動因素和基礎，早日闡明血管早期損傷的機制有助于推遲或阻止糖尿病血管損傷的發展，這對明確糖尿病血管并發癥的確切機制有著重要意義。

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