E－選擇素基因多態性與腦梗死相關性研究

袁 冬，闞春燕，高 鵬，杜丹華，吳 江

E－選擇素基因多態性與腦梗死相關性研究

袁 冬1，闞春燕1，高 鵬2，杜丹華1，吳 江1

目的 探討E－選擇素(E－selectin)及基因A561C多態性與腦梗死相關性。方法 以rs5361位點為遺傳標記，采用聚合酶鏈反應(PCR)和限制性片段長度多態性(RFLP)檢測199例腦梗死組和124例對照組人群E－selectin基因的多態性。結果 腦梗死組與對照組的rs5361位點的等位基因和基因型頻率在兩組中比較，差異均有統計學意義(P＜0.05);相對風險度分析，C等位基因攜帶者患腦梗死的風險是A等位基因的5.4倍。腦梗死組AC+CC基因型頻率明顯高于對照組(P=0.00)。結論 E－selectin基因A561C多態性與腦梗死的發病相關，C等位基因可能是腦梗死發生的危險因素之一。

E－選擇素;腦梗死;基因多態性

腦梗死(cerebral infarction，CI)因其具有高發病率、高致殘率、高復發率和高死亡率的特點，已成為嚴重危害人類健康的重要疾病［1］。傳統危險因素如吸煙、不良飲食習慣、血脂異常、高血壓、糖尿病等與腦梗死的發生有關。而近年來的遺傳學研究表明腦梗死的發生具有遺傳易患性。動脈粥樣硬化(AS)導致的腦梗死是最常見的類型，亦是腦血管疾病重要的病理基礎，而內皮細胞損傷則是動脈粥樣硬化的始動環節。E－選擇素(E－selectin)是一種細胞粘附分子，可在損傷內皮細胞的表面高度表達，從而促進動脈粥樣硬化斑塊的形成［2］。因此，本研究選擇選擇素基因(EALM1)A561C作為動脈粥樣硬化性腦梗死的候選基因，通過對該基因多態性的研究，探討其與腦梗死之間的關系。

1 資料和方法

1.1 研究對象 選取2011～2012年期間在吉林大學第一醫院神經內科住院的199例腦梗死患者作為病例組，其中男143例，女56例，年齡29～83歲，平均60.1±10.7歲，經神經系統檢查、TCD和頸動脈超聲及頭部CT或MRI檢查，診斷為動脈粥樣硬化性腦梗死，除外房顫、腫瘤等栓子來源的腦栓塞性疾病，除外肝腎功能不全、血液系統疾病。并盡量收集完整的臨床資料，包括患者的一般情況(性別、年齡、民族、體重指數、腰圍、煙酒嗜好)、既往病史、家族史、血脂、血糖、血尿常規、腎功能、心電圖等。對照組來自吉林大學第一醫院體檢中心的健康體檢者，共124例，其中男97例，女27例，年齡25～87歲，平均58.2±8.2歲。經病史詢問無腦血管病史，部分經頭部CT或MRI證實。入組對象簽署知情同意書，并采集全血用于DNA提取。

1.2 實驗方法 (1)標本采集:抽取患者、對照者空腹外周靜脈血置于－20℃冰箱保存備用。(2)基因組DNA的提取:采用Wizard基因組DNA提取試劑盒(美國Promega公司)抽提基因組DNA。(3)基因組DNA濃度與純度測定:用ND－1000紫外/可見光分光光度計(NanoDrop，美國)進行定量測定，調整模板DNA濃度在25－50ng/μl。(4)聚合酶鏈反應(PCR):基因引物由上海生工生物工程技術有限公司合成，其核苷酸序列如下:上游引物:5’－TATGACACCATCTGCACCAG－3’，下游引物:5’－GCACAGTAATAGTCCTCCTC－3’。 反 應 體 系(20μl):DNA模板1μl、PCR引物2μl(上游引物、下游引物各1μl)、2×Taq DNA Starmix 10μl、ddH2O 7μl。PCR反應條件:預變性94℃ 2min，變性94℃30s，退火52℃ 30s，延伸72℃ 30s，共進行35個循環，最后延伸72℃5min。(5)PCR產物的檢測:取PCR擴增產物2μl進行2%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(UVP，美國)下觀察結果。(6)限制性核酸內切酶酶切:PCR擴增產物 15μl，PstI(MBI Fermentas)0.7μl，10×Buffer 2μl，BSA 0.2μl。37℃溫育箱孵育10h。(7)電泳判斷基因型:酶切產物加樣在含花青素、濃度為2%的瓊脂糖凝膠上電泳，電壓為115V，電泳35min，經凝膠成像與分析系統觀察電泳圖。

1.3 統計學分析 應用擬和優度檢驗分析病例組和對照組基因型頻率的分布是否符合Hardy－Weinberg(H－W)平衡;UNPHASED遺傳學軟件應用cocaphase對等位基因頻率進行分析，SPSS 15.0軟件應用卡方檢驗對基因型頻率進行分析。P＜0.05認為有統計學意義。

2 結果

2.1 E－selectin基因型分析 EALM1基因rs5361位點PCR擴增產物片段大小為266bp，根據限制性內切酶PstI酶切片段的情況，基因型有3種，AA型(199bp，66bp 2條帶)，AC型(266bp，199bp，66bp 3條帶)，CC型(266bp 1條帶)(見圖1、圖2)。

2.2 腦梗死組與對照組E－selectin基因型及等位基因頻率比較 擬和優度檢驗表明病例組(χ2= 18.152，P=0.00)和對照組(χ2=17.887，P=0.00)的基因型分布均未偏離H－W平衡，說明該群體為隨機婚配。E－selectin A561C基因型在兩組的分布差異具有顯著性(χ2=18.152，P＜0.05，95%CI:2.57～12.85)，AC+CC基因型患腦梗死的風險是AA基因型的5.75倍。cocaphase分析表明腦梗死組C等位基因頻率(11.8%)明顯高于正常對照組(2.4%)，差異有顯著性(OR=5.4，χ2=17.887，P＜0.05，95%CI:2.47～11.8)(見表1)。

圖1 EALM1基因A561C多態性2%瓊脂糖凝膠電泳結果

表1 腦梗死組與對照組E－selectin A561C基因型及等位基因頻率的分布

3 討論

動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是腦梗死最常見的病因。研究表明，AS可能是一種慢性炎癥狀態，且局部和全身炎癥反應貫穿了從脂紋形成到斑塊破裂的全過程。E－selectin作為體內的一種促炎細胞因子，與動脈粥樣硬化的形成、高血壓、血脂異常等腦梗死高危因素之間關系密切。E－selectin能夠介導活化的內皮細胞與白細胞的起始粘附，繼而介導白細胞活化，使白細胞在損傷區域滾動，引起一系列炎癥反應，導致AS的形成［3］。因此，炎癥反應在動脈粥樣硬化的發生、發展及并發癥的產生中起著重要作用［4］。

E－selectin即人類白細胞分化抗原CD62E，是選擇素家族(SF)成員之一，也是唯一僅表達于活化的內皮細胞表面的粘附分子(Ams)［5］。分子遺傳學的研究表明，EALM1位于1號染色體長臂，全長約13kb，由14個外顯子和13個內含子組成，外顯子大小22～189bp不等，內含子長度106～1300bp不等，相對分子質量為115kD，由589個氨基酸殘基構成，是細胞表面的單鏈跨膜糖蛋白。通過對E－selectin進行研究，發現E－selectin基因存在著基因變異及基因多態性。

德國學者Wenze等l［6］在1994年發現E－selectin基因多態性只有在激活的內皮細胞中表達，并證實EALM1第4外顯子存在A561C基因多態性，認為它可能影響E－selectin的生物活性及相關疾病的發生、發展和轉歸。

韋葉生等［7，8］對廣西壯族人群血清中EALM1 A561C基因多態性進行分析，研究發現 EALM1 A561C多態性與腦梗死的發病具有相關性，C等位基因可能是廣西地區壯族人群腦梗死發病的遺傳易感基因。同樣采用PCR分子生物學技術檢測將腦梗死患者與正常人E－selectin基因型作比較，結果發現腦梗死患者E－selectin基因A561C多態性分布與正常人比較，差異具有顯著性(P＜0.05)，腦梗死患者E－selectin血清水平顯著高于對照者，與國外文獻［9］報道一致。為進一步研究E－selectin基因多態性與腦梗死的相關性，我們采用PCR－RFLP技術檢測了199例腦梗死患者和124例正常人E－selectin基因型，結果發現腦梗死患者EALM1 A561C多態性分布與正常人比較差異具有顯著性(P＜0.05)，其中攜帶AC+CC基因型個體患腦梗死的風險約是AA基因型的5.75倍，提示C等位基因可能是腦梗死的遺傳易感基因，攜帶C等位基因的個體可促進E－selectin的高度表達進而增加罹患腦梗死的風險，這與韋葉生等［7］報道相一致。

綜上所述，腦梗死是一種多基因遺傳和多環境因素共同作用的復雜疾病，環境因素雖然可使其發病率增高，但遺傳因素在腦梗死發病機制中的地位仍不容忽視。E－selectin作為體內的一種不可缺少的細胞粘附因子，具有表達的瞬時性及特異性［10］，它的功能日益受到重視。目前，關于腦梗死相關基因的研究還處在初級階段，還有待進行大規模、多地域、多民族的系統研究，相信隨著對E－selectin研究的深入，必將給腦梗死的治療開辟更為廣闊的未來。

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Association study between a polymorphism of E-selectin gene and cerebral infarction

YUAN Dong，KAN Chunyan，GAO Peng，et al.(Department of Neurology，The First Hospital of Jilin University，Changchun130021，China)

ObjectiveTo detect the E－selectin and A561C gene polymorphism in patients with cerebral infarction. Methods Genotypes of E－selectin in 199 patients with cerebral infarction and 124 controls were typed by PCR－RFIP，SNPrs5361.ResultsThere was significant difference in frequencies of allele and genotype in E－selectin A561C polymorphism between patients group and control group(P＜0.05).Relative risk analysis indicated that the risk of cerebral infarction in C allele was 5.4 times higher than that in A allele.And the frequency of AC+CC genotypes in patients group was significant higher than control group(P=0.00).ConclusionE－selectin A561C polymorphism was associated with cerebral infarction，and C allele might be a risk factor of cerebral infarction.

E－selectin;Ccerebral infarction;Genes polymorphism

R743.3

A

1003－2754(2013)03－0208－03

2013－01－06;

2013－02－28

衛生部臨床重點項目

(1.吉林大學白求恩第一醫院神經內科，吉林 長春130021;2.吉林大學白求恩第一醫院內分泌科，吉林長春130021)

吳 江，E－mail:sjnkwujiang@sina.com