Aβ25-35寡聚體對大鼠海馬神經細胞的活性影響及形態學觀察

黃昕艷， 趙錦程， 尉榮翠， 楊 智， 劉 爽， 朱曉峰

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種慢性進行性神經退變性病變，其典型的臨床病理學改變為β淀粉樣蛋白(β-amyloid protein，Aβ)沉積、神經元纖維纏結和神經元缺失［1］。Aβ是老年斑的核心成分，在AD的發生、發展過程中起關鍵作用，本實驗旨在通過Aβ25-35寡聚體誘導海馬神經元細胞損傷來探討其活性及形態學指標的變化，篩選Aβ25-35寡聚體致傷條件下適宜的AD細胞模型。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)動物:新生 Wistar大鼠(1～3d)，由佳木斯大學實驗動物中心提供。(2)主要試劑:DMEM/F12干粉培養基、B27、Neurobasal-A培養基、胎牛血清、胰蛋白酶(購于美國Gibco公司);Aβ25-35、二甲基亞砜(DMSO)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、HFIP(六氟丙醇)購于武漢博士德公司;兔抗大鼠神經元特異性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)單克隆抗體、SABC即用型試劑盒、DAB顯色試劑盒(購于Boster公司);青霉素、鏈霉素(華北制藥股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 原代海馬神經元培養 出生1～3d內的Wistar大鼠，無菌條件下斷頭，在冰浴的D-hank s液中取腦并分離出雙側海馬組織，剪切成約1mm×1mm×1mm的組織塊，0.125%胰酶37℃消化約20min。用含體積分數為10%胎牛血清的DMEM/F12培養基中終止消化，用口徑光滑的小吸管反復吹打分散，200目細胞篩過濾后，1000r/min，離心5min，棄掉上清液，加入培養基重懸，制成(2～3)×105個/ml密度的細胞懸液，接種于預先用0.1mg/ml多聚賴氨酸包被的96、24、6孔板中。置于37℃、5%CO2培養箱內培養，24h后換成Neurobasl+B27(2%)培養基，以后每3d換液1次。

1.2.2 神經元鑒定 培養至7d的神經細胞，以PBS輕洗3遍，4%多聚甲醛固定30min后，PBS洗2次。0.4%TritonX-100破膜 20min，PBS洗 3遍，山羊血清封閉30min，滴加NSE(1∶200稀釋)一抗，4℃濕盒內孵育過夜。次日PBS洗3遍，加二抗室溫避光孵育50min，PBS洗3遍;加新鮮配制的DAB溶液顯色，待顯色充分后，加入三蒸水終止反應，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡觀察，(PBS代替一抗做陰性對照)。

1.2.3 實驗分組 將原代培養8d后的神經元隨機分為5組:正常對照組、損傷組，加入終濃度分別為 1.0、5.0、10.0、20.0μmol/L 的 Aβ25-35寡聚體，Aβ25-35寡聚體的制備參考王建秀等文獻［2］，繼續培養24h。

1.2.4 神經細胞形態學觀察和定量分析Aβ25-35寡聚體孵育24h后，于倒置顯微鏡下觀察其存活情況和形態，隨機選取30個視野，記錄每個視野內有突起的細胞數和突起總數，同時目鏡微尺測量突起的長度，重復3次。

1.2.5 MTT法檢測細胞活性 采用MTT比色法檢測培養細胞的存活率。按上述分組處理24h后，向96孔板中各組細胞分別加入 5mg/ml MTT20μl，37℃繼續培養4h后棄上清液，每孔加入150μl DMSO，振蕩10min，待紫色結晶完全溶解后，用酶標儀檢測各組細胞570nm吸光度值(opti-cal density，OD)。每個濃度設5個復孔，計算其平均值，同時設不加細胞的空白孔。根據公式計算:細胞存活率(%)=處理組細胞OD值/對照組細胞OD值×100%。

2 結果

2.1 神經元形態學觀察及鑒定 接種后的海馬神經細胞呈圓形，單個均勻分布，2h后開始貼壁，培養24h后細胞大部貼壁且部分已長出突起。隨培養時間延長，突起逐漸增多、延長并交織成網。胞體呈多角形或橢圓形，周圍有光暈，胞體體積較大，透光性強，核大;培養至7d的細胞胞體飽滿、有立體感;突起明顯增多、增長、交織成網、細胞生長成熟。與陰性對照、陽性對照比較，NSE免疫染色顯示95%以上的培養細胞為陽性染色，符合細胞原代培養純度要求(見圖1)。

圖1 神經細胞原代培養(×100)

Aβ致傷模型組可見到部分神經細胞出現胞體縮小，細胞周圍暈光不強;細胞突起消失或明顯減少、縮短，細胞碎片增多，甚至細胞崩解，神經細胞數目下降等變化。Aβ1.0μmol/L組神經細胞形態基本正常，貼壁良好、突起較長，可相互連接成網絡。Aβ5.0μmol/L組神經細胞生長狀態不如正常對照組旺盛，神經元突起數目、長度與正常對照組相比有明顯的差異(P ＜0.05，P ＜0.01)。Aβ10.0μmol/L組神經細胞存活狀態欠佳，突起變短，有較多的圓形及浮細胞，其突起的細胞數、神經元突起數目、長度與正常對照組相比有顯著的差異(P＜0.05，P＜0.01，P ＜ 0.01)。Aβ20.0μmol/L 組神經細胞生長較差，多數細胞突起變短、消失，細胞碎片較多。其突起的細胞數、神經元突起數目、長度與正常對照組相比有顯著的差異(P ＜0.01，P ＜0.01，P ＜0.01)，見圖2、表1。

2.2 Aβ25-35寡聚體誘導損傷后神經細胞存活的影響 MTT測定結果顯示，Aβ25-35寡聚體可導致神經細胞抑制，且神經細胞抑制表現為與Aβ寡聚體濃度依賴性關系，即隨著Aβ寡聚體濃度增加神經細胞，存活率逐漸下降，其中20μmol/L組最明顯，與空白對照組相比，差異有統計學意義(P＜0.05);Aβ25-35寡聚體毒性會導致細胞損傷(見圖2)。

圖2 Aβ不同致傷濃度對原代培養神經細胞的影響(倒置顯微鏡，×100)

表1 Aβ25-35對神經細胞形態學改變的影響(χ ± s，n=30)

表2 不同濃度Aβ肽對海馬神經元的影響(±s)

表2 不同濃度Aβ肽對海馬神經元的影響(±s)

與空白對照組比較*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

組別Aβ肽濃度(μmol/L)MTT吸光度(n=6)存活率(%)正常組模型組 1.0 5.0 10.0 20.0 1.23 ±0.05 1.19 ±0.04 0.96 ±0.06 0.87 ±0.05*0.62 ±0.03＊＊98.24 ±2.17 89.86 ±3.23 75.95 ±2.05 58.86 ±3.11

3 討論

Aβ級聯學說的提出源自對AD的神經病理特征的發現，已經確認老年斑的主要構成物質是β淀粉樣物質，Aβ在腦內異常聚集引起神經毒性，包括直接毒性和增強、放大各種傷害性毒性，導致神經細胞死亡［3］。

目前認為，Aβ在大腦皮質內的蓄積是AD病理發生過程中的一個早期必然事件［4］，研究表明，Aβ在形成纖維性沉積前的中間體狀態，即Aβ寡聚體亦可產生神經毒性作用。動物實驗研究表明，Aβ寡聚體可以在生理水平明顯抑制大鼠海馬的突觸傳遞［5］。且發現在AD發病早期還未出現明顯的老年斑之前，其認知功能的減退與可溶性Aβ水平及突觸功能障礙密切相關［6，7］。因此，建立良好而穩定的AD突觸損傷模型對探索AD早期記憶損害事件的成因及AD發病機制的研究非常重要。

Aβ肽全長的第25～35個氨基酸殘基是Aβ的非生理性最小毒性片段，故本實驗以Aβ25-35寡聚體致傷與記憶密切相關的海馬神經元為研究對象，來篩選適宜的AD突觸損傷模型，為AD早期的防治探求的有效的途徑。

Aβ25-35寡聚體致傷 24h后從形態學觀察，Aβ25-35寡聚體可致神經細胞損傷，且神經細胞毒性表現與 Aβ25-35寡聚體呈劑量依賴性關系，其中Aβ25-3520μmol/L組致傷顯著，細胞存活狀態差，有部分細胞脫壁，細胞間網絡消失，細胞外基質雜亂，其突起的細胞數、神經元突起數目、長度與正常對照組相比有顯著的差異(P＜0.01);不適宜作為AD突觸損傷模型進行下一步研究。

Aβ25-3510μmol/L組突起的細胞數、神經元突起數目與Aβ25-3520μmol/L組相比有所改善，突起的細胞數與正常對照組相比有一定差異(P＜0.05)，但神經元突起數及突起的長度與正常對照組相比仍有顯著的差異(P＜0.01)，大部分神經細胞突起已喪失，故也不宜作為適宜的突觸損傷模型。

Aβ25-355μmol/L組細胞生存狀態尚可，突起的細胞數與正常對照組比照差異不顯著，神經元突起數目與正常對照組相比(P＜0.05)，突起的長度與正常對照組相比有顯著的差異(P＜0.01)，損傷模型中神經細胞數量尚穩定，神經元突起數目有部分損失，但尚可作為Aβ致突觸損傷模型做進一步研究。

對于Aβ25-351μmol/L組細胞損傷效果不明顯，神經元突起數、突起長度與正常對照組比較差異不顯著，不宜作為有效的突觸損傷模型。

在MTT測定結果顯示 Aβ25-3510μmol/L組與Aβ25-3520μmol/L組細胞存活率降低較明顯，不適宜作為AD的突觸損傷模型，同樣支持上述結果。

本實驗以Aβ25-35寡聚體致傷海馬神經細胞，篩選出5μmol/L為適宜的AD突觸損傷模型的致傷濃度，希望為AD早期的防治探索更有效的途徑。

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