乳酸桿菌代謝產物對陰道常見致病菌抑制作用的試驗研究

魏利杰，徐琳，王錦卓(.吉林省人民醫院婦產科，吉林長春300;.吉林省長春市婦產醫院麻醉科，吉林長春300)

正常婦女，在雌激素的影響下陰道上皮細胞增生，表層細胞角化，陰道酸堿度保持在4～5，使適應堿性的病原菌的繁殖受抑制，頸管黏液呈堿性，使適應酸性病原菌的繁殖受抑制，當此自然防御功能受破壞時，易導致陰道炎。寄生于陰道內的細菌包括革蘭陽性需氧菌及厭氧菌，各種細菌通過黏附機制生長于陰道黏膜，陰道菌之間相互拮抗、相互依賴，并受機體內分泌的調節和陰道內環境的影響而維持著動態平衡，在正常菌群中，以乳酸桿菌占優勢，陰道上皮的糖原經乳酸桿菌作用分解成乳酸，使陰道局部呈弱酸環境，抑制其他細菌過度生長，從而維持陰道正常菌群。然而由于個體激素水平的巨大差異、生活方式、藥物使用等方面的不同，易導致細菌的抗藥性和機體的菌群失調，進而使得陰道炎性反應遷延反復[1]。目前對于各種原因所致陰道炎的治療方法仍以抗菌藥物為主，未注重對陰道內環境的恢復和調整，且易造成病情反復。故此，對維持陰道的酸堿平衡，日益引起重視。目前資料表明，非特異性細菌性陰道炎發生可能與陰道乳酸桿菌數量的減少或缺失相關[2]。本文通過試驗研究觀察了乳酸桿菌代謝產物對女性陰道常見致病菌抑菌作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株來源:乳酸桿菌、腸球菌、銅綠假單胞菌、傷寒桿菌、大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌均由吉林大學白求恩醫學院微生物教研室惠贈。

1.1.2 主要試劑:IMDM(美國GIBCO)，營養肉湯培養基(杭州天和微生物制劑有限公司)、小牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所生產)，營養瓊脂培養基。

1.2 試驗方法

乳酸桿菌代謝產物的制備將對數生長期的乳酸桿菌接種于LC液體培養基，37℃培養24 h，當濃度達到1×1010個/ml時濾器除菌，用無菌瓶分裝濾液分裝，置4℃冰箱備用。

營養瓊脂平板培養基的制備取滅菌后的營養瓊脂培養基傾注于直徑10 cm的無菌平皿內，控制培養基的厚度0.5～0.6 cm，冷卻后置4℃冰箱備用。

細菌液的制備取對數生長期的大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、傷寒桿菌和腸球菌分別接種于10 ml的無菌肉湯培養基中，置37℃恒溫培養箱中培養18 h后取出，配制成1×106個/ml菌液，置4℃冰箱備用。

陰道上皮細胞的制備取25位年齡20～50歲，婦科檢查正常，月經周期10～14 d的婦科門診就診者的陰道上皮細胞。用刮板輕輕刮去陰道后壁上段細胞，懸浮于RPMI1640培養液中，反復吹打，離心5 min，重復3次。使細胞濃度為2×106個/ml，接種于24孔細胞培養板中，每孔1 ml置CO2孵育箱中培養6 h，用無菌生理鹽水洗滌3次。

乳酸桿菌對各種常見致病菌抑菌環試驗研究取制備好的培養板，將配置好的菌液0.5 ml滴加在培養板中央，用無菌L棒將細菌涂均，每種細菌做3塊培養板，每塊培養板均勻放置4個無菌的藥敏杯，試驗組:其中2個藥敏杯中加入0.5 ml制備好的乳酸桿菌代謝產物;對照組:另2個藥敏杯中加入0.5 ml無菌生理鹽水。分別做記號標志，放置37℃恒溫培養箱中培養24 h。

乳酸桿菌對各種常見致病菌陰道上皮細胞黏附抑制試驗研究取上述制備好陰道上皮細胞的24孔培養板，第1～3行每孔分別加入乳酸桿菌代謝產物濾液0.5 ml，為試驗組，第4～6行不加，為對照組。從第1行至第6行每孔分別加入0.2 ml制備好的大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、傷寒桿菌、腸桿菌和白色念珠菌菌液，置CO2孵育箱培養2 h，用無菌生理鹽水洗滌3次。

1.3 統計學方法:每次試驗都重復3次，數值用均數±標準差(±s)來表示，比較分析用t檢驗。

2 結果

乳酸桿菌代謝產物對陰道常見致病菌的抑菌情況分析采用抑菌環試驗，觀察此產物對腸桿菌、大腸埃希菌、胞菌、銅綠假單傷寒桿菌、白色念珠菌、金黃色葡萄球菌等常見致病菌的抑制生長情況，同時分別提取3塊各種菌試驗培養板的抑菌環大小的平均值作為試驗結果，并與對照組相對比，結果見表1。

表1 乳酸桿菌代謝產物對常見致病菌的抑菌環直徑分析(±s)

表1 乳酸桿菌代謝產物對常見致病菌的抑菌環直徑分析(±s)

菌株strains抑菌環直徑(cm)試驗組1.7±0.20.0銅綠假單胞菌2.7±0.60.0金黃色葡萄球菌2.8±0.40.0傷寒桿菌1.5±0.10.0腸球菌0.00.0白色念珠菌生理鹽水對照組大腸埃希菌0.00.0

乳酸桿菌代謝產物抑制各種常見致病菌與陰道上皮細胞黏附情況分析采用革蘭染色法，鏡下觀察乳酸桿菌代謝產物對大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、傷寒桿菌、腸桿菌和白色念珠菌與陰道上皮細胞的黏附抑制情況。各孔隨機計數100個細胞，以黏附10個以上細菌為黏附陽性，取各孔平均數為試驗結果，結果見圖1。

圖1 乳酸桿菌代謝產物對常見致病菌與陰道上皮細胞黏附能力的抑制作用分析

3 討論

健康女性陰道內存在許多寄生細菌，包括需氧菌和厭氧菌。主要的革蘭陽性菌有:乳酸桿菌、棒狀桿菌、腸球菌等;主要的革蘭陰性菌有:大腸埃希菌、加德納菌、動彎桿菌等其中許多成員具有潛在的致病作用[2]。本研究結果表明，乳酸桿菌代謝產物對大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和傷寒桿菌有抑菌作用，其抑菌環直徑分別為(1.7±0.2)cm、(2.7±0.6)cm、(2.8±0.4)cm和(1.5±0.1)cm，與對照組抑菌環直徑為0相比具有明顯差異(P﹤0.05)，這一結果為臨床應用乳酸桿菌及其制劑提供試驗基礎。本試驗還發現，乳酸桿菌代謝產物對腸球菌和白色念珠菌未見明顯抑制效果，因此抑菌環試驗尚不能闡述乳酸桿菌的抗病機理，推測乳酸桿菌對腸球菌和白色念珠菌的抑制作用可能與代謝產物直接殺菌無關，是否存在其他抑制的間接作用仍需其他試驗進一步驗證研究。

陰道的酸性環境是維持陰道的內環境平衡的重要條件，乳酸桿菌產生的乳酸可抑制類桿菌及其他需氧菌、兼性厭氧菌的生長[3]。本研究顯示乳酸桿菌代謝產物抑制大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、傷寒桿菌、腸桿菌、白色念珠菌和金黃色葡萄球菌對陰道上皮細胞的黏附作用效果好，可以明顯地降低它們與陰道上皮細胞黏附數量，試驗組與陰道上皮細胞黏附數分別為29.4±4.9、36.7±5.3、29.1±4.1、22.5±3.2、24.7±2.9和43.1±3.9，明顯低于對照組的黏附陰道上皮細胞數目的91.8±12.1、90.1±10.3、95.6±13.2、90.6±9.8、87.5±10.1和94.9±13.2，兩組相比較具有顯著性差異(P﹤0.05)。這一結果提示，乳酸桿菌對上述常見致病菌與陰道上皮細胞的黏附具有明顯的抑制作用。根據這一結果推測，高濃度的乳酸桿菌代謝產物可能會競爭性地抑制陰道病原菌的黏附能力，或從某一環節阻斷病原菌對陰道上皮細胞的黏附能力，故應用的乳酸桿菌及其代謝產物對陰道病原菌有抑制作用，但是否還有抑制其他因子的分泌、存在濃度抑制等需要進一步試驗研究來驗證。

綜上所述，本研究證實乳酸桿菌及其代謝產物對白色念珠菌、銅綠假單胞菌、腸桿菌、傷寒桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌等感染所致的女性陰道炎性反應有較好的治療作用和預防功能，與目前以乳酸桿菌為主導的較健康的陰道微生態有利于提高陰道對各種病原微生物抗感染能力的相關報道一致，并且乳酸桿菌的代謝產物沒有不良反應，為陰道炎的治療研究提供了一種新的有效方法。

[1] 康白，呂虎，傅曉麗.對DM8909菌株治療菌群是條性陰道病作用機制的研究[J].中國微生態學雜志，2001，13(4):192.

[2] Redondo LV，Cook RL，Sobel JD.Emerging role of lactobacilli in the control and maintenance of the vaginal bacterial nicoflora[J].Rev lnfet Dis，1990，37(12):856.

[3] Donati L，Di Vico A，Nucci M.Vaginal microbial flora and outcome of pregnancy[J].Arch Gynecol Obstet，2010，281(4):589.