石蠟包埋組織mi R NA做為腫瘤標志物的研究進展

傅文凡 黃豪達 江澤勇 戴 璐 趙 健

廣州醫學院附屬腫瘤醫院肺腫瘤科，廣東廣州 510095

miRNA是一類長為19～25nt小分子單鏈RNA，其與靶標基因3'UTR結合，通過降解mRNA或抑制其翻譯，從而在轉錄后對靶標基因的表達水平進行調控。與腫瘤的發生、轉移、耐藥、預后等密切相關。目前研究miRNA的樣本多來源于新鮮組織和細胞。最近發現福爾馬林固定石蠟包埋的組織（Formalin-fixed and Paraffin-embedded,FFPE）中miRNA保存比較完整并與新鮮組織中的miRNA高度相關[1]，為miRNA的研究開辟了一個新的途徑。石蠟組織miRNA可能是一種理想的腫瘤標志物,該文就該領域的最新進展進行綜述。

1 石蠟包埋組織miRNA中存在miRNA

長期以來，醫療和科研機構采用福爾馬林固定和石蠟包埋方法保存病理組織。現在全世界已保存有大量的石蠟組織樣本，覆蓋所有已知的疾病。每個石蠟組織樣本都具有特別的價值，關聯著大量的病人數據。所以石蠟組織標本是人類對疾病研究寶貴的信息庫，尤其是回顧性研究和少見疾病的研究。然而通常mRNA甚至DNA、蛋白都有不同程度的降解。但有研究表明，盡管大分子RNA可能會發生降解，但在一般情況下，小分子RNA是不受石蠟固定影響。此外，已有許多研究證實miRNA受FFPE處理的影響非常小，并且從FFPE樣本中提取的microRNA與冷凍組織樣本一樣，可提供可信的表達譜。甚至保存長達30年的FFPE樣本仍可提供可信的microRNA表達譜數據[2]。

2 石蠟包埋組織miRNA的提取

石蠟組織樣本可經過異丙醇和乙醇脫蠟后通過trizol法提取總RNA，成本較低。但普通的過柱法效果較差，可能與過柱時小RNA被吸附有關。目前已有多種商品化試劑盒用于從FFPE樣本中提取microRNA，例如Ambion公司的RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit for FFPE，Qiagen公司的 miRNeasy FFPE Kit，Norgen公司的FFPE RNA Purification Kit等。試劑盒提取簡單快速，并且易于富集miRNA，但成本較高。

3 石蠟組織miRNA的檢測

對于發現新的miRNA分子通過小分子RNA建庫克隆測序是經典方法。首先構建cDNA文庫，再將這些cDNA進行克隆、測序，然后生物信息學分析，最后將具有發夾結構的小分子RNA進行Northern雜交以驗證。

石蠟組織樣本中的已知miRNA檢測可以采用miRNA芯片技術，能夠發現石蠟組織樣本中的miRNA表達譜的差異，利用被篩選出的具有差異的miRNA作進一步研究。目前已有多種類型的miRNA檢測芯片可以選用。 但是基因芯片檢測方法的重現性和準確性相對較差,一般多用于初篩,對獲得的結果通常需要進一步驗證。RT-PCR技術是目前最常用的驗證miRNA的技術，常見的有Taqman探針法、SYBR Green法、莖環RT-PCR法。也有人采用表面增強拉曼光譜法、磁珠流式檢測等。

4 石蠟組織miRNA與新鮮組織miRNA的相關性

目前已經有多項研究表明，石蠟組織中的miRNA與新鮮組織的miRNA有良好的相關性，Xiao Zhang[3]將7對匹配的石蠟包埋組織和新鮮冰凍組織進行miRNA檢測，spearman相關指數為0.847～0.948。Jinghuan Li[4]做了類似的研究發現兩者的相關系數R20.95，并且認為在總RNA量相當時石蠟中microRNA含量比新鮮組織多。有人比較石蠟和冰凍組織micorRNA及mRNA表達的相關性，發現microRNA高度相關，mRNA則較差。

5 石蠟包埋組織miRNA在腫瘤檢測中的應用

由于石蠟組織中miRNA與新鮮組織中的miRNA有良好的相關性，部分學者利用石蠟組織進行了研究。Danit Lebanony[5]利用microRNA做為標志物區分鱗癌和其他非小細胞肺癌，其中hsa-miR-205可區分鱗癌和其他非小細胞肺癌的敏感度96%特異性90%。Nitzan Rosenfeld[6]則通過實驗發現石蠟中miRNA不僅保存完好，并且通過miRNA可以區分組織來源。

miRNA與mRNA相比較小、不易降解、缺乏poly A加尾結構，因此受福爾馬林固定和石蠟包埋等處理的影響要小。石蠟樣本miRNA的特點有利人類更好的利用現有的最大標本庫，為探討腫瘤的發生、發展、預后等等提供又一有力手段。

[1]Wang F,Wang L,Briggs C，et al.DNA degradation test predicts success in whole-genome amplification from diverse clinical samples[J].J Mol Diagn，2007,9(4):441-451.

[2]von Ahlfen S,Missel A,Bendrat K.Determinants of RNA quality from FFPE samples[J].PLoS One，2007，5，2(12):1261.

[3]Zhang X,Chen J,Radcliffe T，et al.An array-based analysis of microRNA expression comparing matched frozen and formalin-fixed paraffin-embedded human tissue samples[J].J Mol Diagn，2008，10(6):513-519.

[4]Li J,Smyth P,Flavin R，et al.Comparison of miRNA expression patterns using total RNA extracted from matched samples of formalin-fixed paraffin-embedded(FFPE)cells and snap frozen cells[J].BMC Biotechnol，2007，29（7）:36.

[5]Lebanony D,Benjamin H,Gilad S，et al.Diagnostic assay based on hsamiR-205 expression distinguishes squamous from nonsquamous nonsmall-cell lung carcinoma[J].J Clin Oncol，2009，27(12):2030-2037.

[6]Rosenfeld N,Aharonov R,Meiri E，et al.MicroRNAs accurately identify cancer tissue origin[J].Nat Biotechnol，2008，26(4):462-469.