乳腺癌細(xì)胞凋亡指數(shù)、PCNA、PgP與乳腺癌預(yù)后相關(guān)性的研究

張秀梅 王玉梅

乳腺癌是婦女最常見的腫瘤。近年來，乳腺癌的發(fā)病率呈迅速上升趨勢，其治療和預(yù)后一直是人們關(guān)注的熱點(diǎn)，腫瘤的發(fā)病與細(xì)胞的凋亡、細(xì)胞的增殖的失衡密切相關(guān)，凋亡作為一種細(xì)胞自主的有序性死亡，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展之間的關(guān)系越來越受到重視。化療是治療乳腺癌的手段之一，化療效果差也是困擾臨床醫(yī)生問題，腫瘤細(xì)胞對多種化療藥物產(chǎn)生交叉耐藥，是造成腫瘤化療失敗的原因。用免疫組化方法檢測AI、PCNA、PgP在乳腺癌組織中的表達(dá)，探討在乳腺癌預(yù)后中的作用具有重要意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2005～2010年手術(shù)的80例乳腺癌石蠟包埋病理標(biāo)本，患者均為女性，年齡33～82歲，平均49.2歲，將組織標(biāo)本修整后，制成4μm厚的石蠟切片。在檢測細(xì)胞凋亡的同時(shí)，取一套重復(fù)切片，進(jìn)行常規(guī)的HE染色，請病理高級醫(yī)師閱片.核實(shí)原病理診斷，并確定病程組織學(xué)分類及分化程度，所有病例均采用WHO制定的乳腺癌組織學(xué)分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織學(xué)分級，術(shù)前患者未經(jīng)藥物及其他輔助方法治療。

1.2 方法 應(yīng)用免疫組化技術(shù)，用原位細(xì)胞凋亡檢測(TUNEL)試劑盒，對單細(xì)胞水平的凋亡進(jìn)行免疫組化檢測和量化分析。TUNEL試劑盒購于福建邁新生物技術(shù)開發(fā)公司，用PBS做陰性對照，用已知的陽性切片作為陽性對照。具體操作步驟簡述如下:二甲苯脫脂，梯度酒精水化后，用蛋白酶K消化，然后加入0.3%的H2O2甲醇溶液室溫下孵育，在37℃與TUNEL反應(yīng)液反應(yīng)60 min，37℃孵育盒中與辣根過氧化酶抗體結(jié)合后發(fā)色，蘇木精復(fù)染，光鏡下觀察。

1.3 PCNA、PgP免疫組化檢測 所有標(biāo)本經(jīng)10%福爾馬林固定、石蠟包埋、常規(guī)連續(xù)切片，免疫組織化學(xué)染色采用S-P法，檢測程序按試劑盒說明書進(jìn)行，DAB顯色。用已知乳腺癌組織陽性切片做陽性對照，以PBS代替一抗做陰性對照。

1.4 判定標(biāo)準(zhǔn) 細(xì)胞凋亡陽性的判斷:AⅠ以腫瘤細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)光鏡下觀察，陽性細(xì)胞的胞核為棕黃色或棕褐色，呈均勻染色或顆粒狀。觀察陽性細(xì)胞的數(shù)量和分布，以40×10倍顯微鏡計(jì)數(shù)一個(gè)視野內(nèi)的陽性細(xì)胞數(shù)，隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野，求出每個(gè)高倍視野內(nèi)陽性細(xì)胞百分率，即AⅠ。規(guī)定AⅠ＜10%為陰性-，10% ～20%為弱陽性+，20% ～30%為中等陽性++，＞30%為強(qiáng)陽性+++。細(xì)胞凋亡指數(shù)的測定(apoptotic index AⅠ):每張切片選擇5個(gè)陽性染色最明顯高倍視野(×400)計(jì)數(shù)500個(gè)腫瘤細(xì)胞中陽性細(xì)胞所占的百分比。PCNA免疫組化染色陽性部位在細(xì)胞核，PgP效應(yīng)產(chǎn)物為棕黃色顆粒，定位于細(xì)胞膜上，部分胞漿也著色，少數(shù)癌旁正常組織也見PgP表達(dá)，較癌組織染色淺，分布范圍少不均勻。

2 結(jié)果

乳腺癌凋亡細(xì)胞的形態(tài)特征:①乳腺癌凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征:染色質(zhì)定位于細(xì)胞核，呈棕黃色，濃縮的核質(zhì)緊貼余核，部分凋亡細(xì)胞核明顯縮小，但核膜完整。②乳腺癌中細(xì)胞凋亡的發(fā)生率，80例乳腺癌中，僅7例未發(fā)生凋亡，73例有不同程度的凋亡發(fā)生，凋亡發(fā)生率為91.2%。③凋亡細(xì)胞指數(shù)和腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的比較:凋亡指數(shù)的高低與腋窩淋巴結(jié)有關(guān)，54例凋亡指數(shù)在0～0.21的患者中，僅4例出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，26例凋亡指數(shù)在0.25～0.57的病例中，僅3例現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，PCNA陽性率(78.6%)，組織學(xué)分級Ⅲ級乳腺癌PCNA指數(shù)高于I-Ⅱ級組，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組高于未轉(zhuǎn)移組，分化低的癌組織中癌細(xì)胞增殖活性強(qiáng)，容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。PgP陽性表達(dá)率為(28.7%)，高表達(dá)的腫瘤患者對化療敏感性差，生存期有不同程度縮短。

3 討論

細(xì)胞凋亡是惡性腫瘤的自發(fā)現(xiàn)象［1］，是在多種基因調(diào)控下細(xì)胞程序性死亡過程，無論是腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，還是治療與預(yù)后，均與細(xì)胞凋亡有密切關(guān)系［2，3］，乳腺是雌激素作用的靶器官，正常乳腺在月經(jīng)周期束期，細(xì)胞凋亡發(fā)生最明顯［4］;在泌乳乳腺退化時(shí)，細(xì)胞凋亡也很常見，可見乳腺細(xì)胞凋亡和內(nèi)分泌因素有關(guān)。腫瘤從正常細(xì)胞轉(zhuǎn)為腫瘤細(xì)胞的過程中，發(fā)生浸潤、轉(zhuǎn)移是多階段的，轉(zhuǎn)移是一個(gè)逐漸發(fā)展的過程，腫瘤的一部分細(xì)胞還處在癌前細(xì)胞階段，另一部分細(xì)胞已經(jīng)浸潤轉(zhuǎn)移、走向凋亡，腫瘤的新陳代謝越快，出現(xiàn)凋亡細(xì)胞越多，凋亡與增殖呈正相關(guān)，而非想像的那樣，凋亡與增殖呈負(fù)相關(guān)，其機(jī)制可能是同一腫瘤中的不同細(xì)胞亞群為競爭更好的增殖因素而發(fā)生的克隆性清除［5］。認(rèn)為AI乳腺癌預(yù)后的一個(gè)參數(shù)，對凋亡細(xì)胞做為預(yù)后因子的意義以及對凋亡細(xì)胞的判定，AI高的病例，有著預(yù)后好的傾向。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，AI高的病例，淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移度低，從而有可能成為判斷乳腺癌患者預(yù)后的有用指標(biāo)。PCNA是一種僅在增殖細(xì)胞中合成或表達(dá)的核內(nèi)多肽，其合成、表達(dá)與細(xì)胞周期有關(guān)，免疫組化方法顯示PCNA表達(dá)陽性細(xì)胞是處于DNA合成期細(xì)胞，表達(dá)程度能客觀反映腫瘤細(xì)胞的增殖活性，PCNA指數(shù)越高，說明腫瘤細(xì)胞的增殖活性越高，瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的就大，PCNA在腫瘤的良惡性劃分、惡性程度的確定等方面有廣泛的應(yīng)用［6］，PCNA的表達(dá)與腫瘤的大小無關(guān)，結(jié)論與一些報(bào)道結(jié)果一致［7］。多藥耐藥是指腫瘤細(xì)胞對一種抗腫瘤藥物出現(xiàn)抗藥的同時(shí)，對結(jié)構(gòu)不同、作用機(jī)制迥異的另外一些抗腫瘤藥物產(chǎn)生交叉耐藥，腫瘤耐藥與多種耐藥相關(guān)基因有關(guān)，說明在部分初治的乳腺癌病例中確已存在原發(fā)性多藥耐藥(MDR)現(xiàn)象。國內(nèi)李杰等［8］研究后認(rèn)為，PgP表達(dá)陽性與腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和術(shù)前化療密切相關(guān)，Pgp表達(dá)與月經(jīng)狀況、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個(gè)數(shù)、組織學(xué)分級之間均不具相關(guān)性，間接預(yù)示多藥藥是乳腺癌的內(nèi)在表型。在有關(guān)Pgp表達(dá)與乳腺癌預(yù)后方面，PgP陰性表達(dá)無病生存期及總生存期均明顯優(yōu)于Pgp陽性表達(dá)組。Pgp表達(dá)與無病生存期和總生存的縮短均有關(guān)，Pgp表達(dá)是除了腫瘤大小、腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級等證明的預(yù)后因素外。又一獨(dú)立的乳腺癌預(yù)后不良因素，通過本組實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)Pgp在乳腺癌組織中有一定程度的表達(dá);Pgp陽性表達(dá)與乳腺癌患者生存期的縮短有關(guān)，是判斷乳腺癌預(yù)后的有用指標(biāo)。

［1］張淑群，王西京，紀(jì)宗正，等.乳腺癌中端粒酶活性與細(xì)胞凋亡的研究.西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2003，24(3):230-248.

［2］范宇，傅西林，王穎，等.細(xì)胞凋亡及其相關(guān)基因與乳腺癌預(yù)后關(guān)系的研究.中國腫瘤臨床，2000，27(7):524-529.

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