一支半固體盲樣中食源性致病菌分離鑒定

張嶸 江曉 葉艷華 金萍 王煒

質控考核是提高實驗室檢驗水平的重要途徑，是對細菌實驗室檢測質量評價的方法。本實驗室自2003年起每年參加國家認可委（CNAS）組織的檢測能力驗證計劃，均取得了優異成績，現將2012年國家認可委（CNAS）對本中心細菌實驗室復評審進行質控考核結果分析如下。

1 材料與方法

1.1 待測樣品 半固體盲樣管。

1.2 儀器設備 ATB全自動鑒定及藥敏測試儀，恒溫培養箱，生化培養箱等。

1.3 培養基和試劑 ID32E鑒定條，科瑪嘉各種顯色培養基均購自法國梅里埃公司。氯化鎂孔雀綠（MM），亞硒酸鹽胱氨酸增菌液，緩沖蛋白胨水，7.5%氯化鈉肉湯，LB增菌液，GN增菌液，1%葡萄糖肉湯，3%氯化鈉堿性蛋白胨水，mLST-Vm增菌液，mEC肉湯， Bolton肉湯，CIN-I平板，skirrow瓊脂平板，DFI瓊脂平板，B.P平板，MYP平板，伊紅美蘭（EMB）平板，SS平板，HE平板，skirrow瓊脂平板與mCCD平板，克氏雙糖均購自北京陸橋公司，有效期內使用，血平板自行配置。

2 檢測依據

GB/T4789.511，13，14-2003，GB/T4789.7，8，9，36-2008，GB4789.410，30，40-2010[1-3]。

3 檢測與結果

3.1 增菌與分離 無菌操作，打開樣品管，接種環蘸取半固體分別直接劃線HE平板、SS平板、EMB平板、血平板、O157H7顯色平板、科瑪嘉沙門氏菌顯色平板、科瑪嘉副溶血性弧菌顯色平板、skirrow瓊脂平板、mCCD平板、P.K平板、CIN-I平板，DFI顯色平板、科瑪嘉李斯特氏菌顯色平板MYP平板。除CIN-I平板26 ℃培養、skirrow瓊脂平板與mCCD平板42 ℃微需氧培養、科瑪嘉李斯特氏菌顯色平板30 ℃培養，其余平板均置37 ℃需氧培養。同時半固體菌種管直接接種各選擇性增菌液中37 ℃需氧培養（除LB1增菌液30 ℃培養24 h，TTB增菌液42 ℃ 24 h，PSB增菌液26 ℃培養48 h，Bolton肉湯微需氧42 ℃培養24～48 h，mLST 44 ℃24）后再接種相應的平板培養。

3.2 觀察菌落形態（培養24 h） 經過培養后，平板上可見：EMB：圓形，光滑的紫紅色菌落。HE：圓形，光滑邊緣整齊的黃色菌落。CIN-I：圓形光滑凸起濕潤紅色菌落。SS：圓形光滑的濕潤的粉紅色菌落。科瑪嘉沙門氏菌顯色平板：藍綠色圓形光滑的菌落。血平板：淡黃色圓形光滑小菌落。科瑪嘉O157H7顯色平板上：可見圓形光滑藍綠色的菌落。

科瑪嘉付溶血性弧菌平板：未見菌落生長。科瑪嘉李氏菌顯色平板：藍綠色帶暈圈可疑菌落。B.P平板：未見菌落生長。DFI平板：藍綠色圓形光滑的可疑菌落。skirrow瓊脂平板：灰白色菌落。mCCD平板：灰白色菌落。MYP平板：黃色圓形光滑菌落。

觀察增菌液劃線的平板：平板菌落形態同直接劃線平板。

3.3 初步生化試驗及染色鏡檢 將CIN-I上圓形濕潤紅色菌落挑選5個接種改良克氏雙糖26 ℃培養，同時做尿素酶試驗（結果為陰性）。科瑪嘉沙門氏菌顯色平板上藍綠色菌落，O157H7顯色平板上藍綠色菌落，SS平板上粉紅色菌落，HE平板上黃色菌落，DFI平板上藍綠色的菌落，EMB上紫紅色菌落各挑3～5個分別穿刺雙糖斜面37 ℃培養觀察均斜面和底層均變黃產氣，同時挑取上述平板單菌落劃線營養平板并做氧化酶試驗及鏡檢。科瑪嘉李氏菌顯色平板上藍綠色帶暈圈可疑菌落鏡檢為革蘭氏陽性小桿菌，上述其余平板上所有挑選的菌落氧化酶試驗均為陰性，鏡檢均為革蘭氏陰性小桿菌，

3.3.1 挑取科瑪嘉李斯特氏菌顯色平板上藍綠色帶暈圈可疑單菌落穿刺血平板做溶血試驗（37 ℃培養24 h后刺種點周圍可見狹小透明溶血環）及穿刺半固體做動力試驗（30 ℃培養3 d后可見倒傘狀生長）。

3.3.2 挑取DFI平板上藍綠色的可疑單菌落接種TSA平板培養做進一步生化鑒定。DFI平板上轉TSA平板上黃色菌落接種ATB ID32E條經鑒定為阪崎腸桿菌。科瑪嘉李斯特氏菌顯色平板上藍綠色帶暈圈可疑單菌落分純于TSA平板上菌落經APILister鑒定為單增李斯特氏菌。綜上，生化試驗及鏡檢結果得出，該份半固體盲樣中檢出單增李斯特氏菌和阪崎腸桿菌。

4 討論

近年來，由食源性致病菌引起的食物中毒的爆發流行不斷發生，因其發病兇、傳播快、危害大，已引起各國政府的高度重視，除了常見的引起食物中毒的食源性致病菌如沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌外，一些以往并不常檢的食源性致病菌如單核細胞增生李斯特菌、阪崎腸桿菌及空腸彎曲菌等引起的食源性疾病屢有報道，因而增強對其的檢測能力可對食物中毒原因的快速排查具有重要意義。

LM（單核細胞增生李斯特菌）是一種人畜共患的致病菌，由于它引起的感染病死率高，危害大，WHO將其列為20世紀90年代四大食源性致病菌之一，由其引起的食物中毒性疾病在歐美國家常有發生，輕者為一般胃腸炎癥狀，重者主要表現為敗血癥，腦膜炎等甚至死亡[4-6]。雖然我國目前對食品中單核細胞增生李斯特菌檢出未做具體要求，但美國要求其在食品中不得檢出，歐洲各國要求單核細胞增生李斯特菌在每克食品中小于100 cfu，通過近幾年食品污染物調查結果顯示，單核細胞增生李斯特菌在生肉及即食食品中污染率較高，警示大家防止單核細胞增生李斯特菌引起的食物中毒事件發生。

阪崎腸桿菌是乳制品中近幾年新發現的一種致病菌。它是存在自然環境中的一種“條件致病菌”，已被世界衛生組織和許多國家確定為引起嬰幼兒死亡的重要條件致病菌，可導致任何年齡層人群的疾病，尤其是對早產兒、出生體重輕的嬰兒或免疫受損嬰兒的威脅最大，嚴重者可導致敗血癥、腦膜炎或壞死性小腸結腸炎[7]。繼美國FDA2002年在本土某一些國際乳業巨頭生產的嬰兒配方奶粉中檢出阪崎腸桿菌后，2003年又一家國際乳業巨頭公司主動召回在美國生產的一批檢出極微量阪崎腸桿菌的罐裝早產兒特殊配方奶粉，此后成為世界關注的焦點。我國在2005年5月通過《奶粉中阪崎腸桿菌檢測方法》行業標準的審定，對奶粉嚴查此菌。

總之，參加國家認可委（CNAS）組織的檢測能力驗證，提高了實驗室檢驗人員對突發傳染病、細菌性食物中毒的病原診斷及應急能力，促進國家認可實驗室水平的不斷提高。

[1]衛生部.GB/T4789-2003 食品衛生微生物學檢驗[S].北京：中國標準出版社，2003.

[2]衛生部.GB/T4789.9-2008 食品衛生微生物學檢驗[S].北京：中國標準出版社，2008.

[3]衛生部.GB4789.4-2010 食品安全國家標準 食品微生物學檢驗[S].北京：中國標準出版社，2010.

[4]Gasanov Hughes U D，Hansbro P M.Methods for the isolation and identification of Listeria spp and Listeria monocytogenes： a review[J].FEMS Microbial Rev，2005，29（5）：851-875.

[5]周曉輝，焦新安.產單核細胞李斯特菌的分子鑒定與亞分型研究[J].中國人畜共患病雜志，2003，19（5）：44-47.

[6]周曉輝，焦新安，鄧云飛，等.應用PCR快速檢測單核細胞增生李斯特菌的研究[J].揚州大學學報表，2002，23（3）：1-4.

[7]盧雁，王淼，房玉國，等.嬰兒配方粉中阪崎腸桿菌熒光定量PCR檢測方法的建立[J].中國乳品工業，2008，36（7）：47-49.