全血細胞減少性疾病的染色體培養

劉文剛 羅明霞

全血細胞減少（Pancytopenia，PCP）是指外周血中的三種有形成份紅細胞、白細胞、血小板均低于正常值，是各種疾病造成的一種外周血象的改變[1]。多種疾病外周血可呈全血細胞減少，臨床主要表現為貧血、出血、感染。全血細胞減少癥不是一個獨立的疾病，它是一組高度異質性疾病在某一側面的共同表現。按病理生理的不同全血細胞減少可分為由造血系統引起的全血細胞減少和非造血系統疾病引起的全血細胞減少，造血系統引起的全血細胞減少常見于再生障礙性貧血（AA）、低增生性白血病、惡性組織細胞病（惡組）、骨髓纖維化、脾功能亢進、骨髓增生異常綜合征（MDS）、多發性骨髓瘤（MM），非造血系統疾病引起的全血細胞減少常見于淋巴瘤、陣發性睡眠性血紅蛋白尿（PNH）、血栓性血小板減少性紫癜、骨髓轉移癌等。骨髓生成障礙可進一步分為非克隆增殖性疾病與克隆增殖性疾[2]。全血細胞減少性疾病臨床并不少見，常見于血液病，亦可見于其他疾病，因涉及疾病甚多，其診斷難在病因學診斷，應結合臨床、血象、骨髓象、染色體等相關檢查對全血細胞減少性疾病做出診斷。

目前，制備骨髓細胞染色體的方法主要有直接法、短期培養法和同步法。同步法操作技術要求高、分裂指數低，不易推廣[3]。隨著熒光原位雜交技術（FISH）及基因組雜交技術的應用于臨床研究，拓展了染色體的檢查范圍，提高了識別異常染色體的能力，但因熒光試劑和檢測設備昂貴難易廣泛應用于臨床。筆者介紹一種改良的染色體培養方法，應用在培養體系中加入G-CSF的方法對480例全血細胞減少性疾病進行骨髓染色體檢查，獲得了滿意的結果。人們認為在正常情況下為維持生理平衡，有骨髓基質細胞產生極少量的G-CSF，誘導粒細胞的分化和增殖；G-CSF的作用點：G-CSF是通過靶細胞膜上的受體實現作用的，其作用點有兩個：（1）作用于全向造血干細胞使之從靜止期進入增殖期（G0-G1）；（2）特異性地作用于粒系祖細胞CFU-G促進其增殖分化，同時作用于整個粒系：CFU-G （外周血）中性粒細胞；促進增殖分化，功能加強。

1 資料與方法

1.1 一般資料 480例全血細胞減少性疾病均為2003年1月-2011年12月筆者所在醫院血液科門診及住院的患者，全部為初診患者。根據患者的臨床表現、血象、骨髓象、細胞化學、骨髓細胞染色體等檢查結果確定診斷。其中再生障礙性貧血（AA）202例，骨髓增生異常綜合癥（MDS）147例，低增生性白血病85例，巨幼細胞性貧血21例，多發性骨髓瘤（MM）10例，惡性組織性疾病9例，骨髓纖維化6例。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 用肝素抗凝無菌骨髓3~5 ml。

1.2.2 培養體系的配制 按常規方法配制骨髓染色體培養液[4]。1號為瓶1640液8 ml+胎牛血清2 ml，2號為瓶1640液8 ml+胎牛血清2 ml并加入20 U/ml的GM-CSF，培養體系隨用隨配。

1.2.3 短期培養法 將采集的骨髓注入培養體系中，按（3~8）×106/ml細胞密度接種到培養體系中，每位患者接種2瓶。1號瓶為普通的培養體系，2號瓶為加入了20 U/ml的GM-CSF的培養體系。置37 ℃ 5% CO2培養箱中培養24 h，終止前2 h加入濃度為5 μg/ml的秋水仙堿0.2 ml，2 h后將骨髓培養液移入10 ml的離心管內1000 r/min，離心10 min，棄上清后收獲細胞。

1.2.4 低滲處理 收獲細胞后加入預溫至37 ℃的0.075 mol/L的 KCL 8 ml，輕輕混勻后置37 ℃水浴箱內30 min，中間吹打混勻一次。

1.2.5 預固定與離心 低滲完畢后，直接加入新鮮配制的固定液甲醇：冰醋酸（3：1）1 ml，輕輕打勻，立即離心，1000 r/min、離心10 min。

1.2.6 固定與離心 加固定液8 ml，混勻，室溫靜止10 min，1000 r/min、離心10 min。

1.2.7 二次固定與離心 同（1.2.5），離心完置4 ℃冰箱過夜，次日滴片。

1.2.8 滴片與烤片 制成細胞懸液并滴片，滴片后在40烤片機上烘干，之后放置80 ℃左右的烤片機上烘烤4 h，室溫放置2 d后做帶。

1.2.9 G顯帶 2.5%胰酶0.5 ml加入到50 ml的Hank’S液中置37 ℃水浴箱中，15 min后作帶，將老化的標本在胰酶中作用15~25 s，姬姆薩染色5 min，水洗。

1.3 染色體核心型分析 染色體分析的方法包括鏡下分析、照相分析和電腦分析等三種，以鏡下分析最為常用。按《人類細胞遺傳學國際命名體制（ISCN1995）》進行染色體核行分析。至少2個細胞有同樣的染色體增加或結構重排，或者3個細胞有相同的染色體丟失，方可確認為一個異常克隆。一般情況下分析20~30個中期細胞即可，如果發現一種或數種異常細胞，則必須增加分析細胞數。

2 結果

480例全血細胞減少性疾病采用上述方法制備骨髓細胞染色體培養，1號瓶培養結果439例（91.5%）獲得成功，41例培養失敗。2號瓶培養結果480例（100%）全部培養成功。

3 討論

全血細胞減少性疾病的染色體制備，往往分裂相指數低，顯帶效果差，難以廣泛開展。建立穩定的培養、制備、顯帶方法是提高染色體檢查成功率和異常檢出率的關鍵，加入集落刺激因子可以促進骨髓細胞的分裂增殖，獲得較多的中期分列相，筆者對加入G-CSF培養體系對480例全血細胞減少性疾病的骨髓染色體檢查中，無一例失敗全部培養成功，較單一采用直接法或短期培養法成功率高。筆者認為可以推廣，以提高工作效率，可為細胞遺傳學實驗工作參考。

[1] 于華，劉小信，張忠芳.全血細胞減少性疾病的鑒別診斷[J].齊魯醫學檢驗，2005，16（1）：64.

[2] 余潤泉.全血細胞減少癥的鑒別診斷[J].中華內科雜志，2004，10（10）：790-792.

[3] 林梓家，閆桂蘭，張金鵬.即刻低滲法在惡性血液病骨髓染色體制備中的應用[J].中華醫學遺傳學雜志，1998，15（5）：325-326.

[4] 薛永權.白血病細胞遺傳學及圖譜[M].天津：天津科學技術出版社，2003：106.