MiR-150特異調控胸腺iNKT細胞的發育和成熟

鄭全輝 張愛紅 鄭愛華 陸 斌 張慶波 侯志宏 李 娟 陳淑媛

（河北聯合大學基礎醫學院，唐山 063000）

MiR-150特異調控胸腺iNKT細胞的發育和成熟

鄭全輝 張愛紅①鄭愛華①陸 斌①張慶波 侯志宏 李 娟 陳淑媛②

（河北聯合大學基礎醫學院，唐山 063000）

目的:探討miR-150在胸腺傳統T細胞和恒定型自然殺傷性T細胞（iNKT）發育和成熟中的作用。方法:采用Real-time PCR檢測miR-150在胸腺傳統T細胞和iNKT細胞中的表達，流式細胞術檢測miR-150基因敲除小鼠胸腺傳統T細胞和iNKT細胞的發育和成熟。結果:miR-150在胸腺傳統T細胞和iNKT細胞中均有表達，且在iNKT細胞發育成熟過程中表達逐漸增加，缺失miR-150不影響傳統T細胞發育，但導致iNKT細胞發育和成熟障礙。結論:miR-150特異調控小鼠胸腺iNKT細胞的發育和成熟。

miR-150;基因敲除;T細胞;自然殺傷性T細胞

Vα14恒定型自然殺傷性 T細胞（invariant NKT，iNKT）是一群CD1d限制性的T淋巴細胞亞群，起源于CD4+CD8+雙陽性（DP）胸腺前體細胞。在受到CD1d呈遞的脂類抗原如α-半乳糖神經酰胺鞘氨醇（α-GalCer）活化后，iNKT細胞能在短時間內大量產生IFN-γ、IL-4等細胞因子，在抗感染、維持自身耐受和腫瘤治療中發揮重要作用［1-3］。

在小鼠胸腺，表達Vα14-Jα18T細胞受體α鏈的DP胸腺前體細胞經歷CD1d的陽性選擇后，CD24表達降低并伴隨著CD44和NK1.1表達的逐漸增加，開始一系列的發育和成熟過程。iNKT細胞在胸腺內發育主要分為三個階段，初始階段iNKT細胞表現為 CD24－CD44－NK1.1－（Stage 1），此后CD44表達開始增加，表現為CD24－CD44+NK1.1－（Stage 2），成熟階段的iNKT細胞NK1.1表達顯著增加，表現為 CD24－CD44+NK1.1+（Stage 3）［4］。成熟 iNKT細胞表現為活化/記憶細胞表型（CD62L－CD69+CD44+）并可進一步分為 CD4+單陽性和 CD4－CD8－雙陰性兩個亞群［5］。

microRNAs（miRNAs）屬于短鏈非編碼RNAs，長度為20～23nt，通過與靶mRNA 3'端非翻譯區結合，導致靶mRNA降解或抑制其翻譯，負向調節靶基因的表達［6］。miR-150主要表達在成熟的T細胞和B細胞中，miR-150缺失導致B細胞異常擴增，并導致體液免疫應答顯著增強［7］。而miR-150是否調控傳統T細胞和iNKT細胞的發育和成熟，目前還不清楚。我們的研究發現:雖然miR-150在胸腺iNKT細胞中表達低于傳統T細胞，但miR-150缺失不影響胸腺傳統T細胞的發育，而特異性地使小鼠iNKT細胞減少，發育阻斷在終末成熟階段。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 小鼠 C57BL/6背景的miR-150基因敲除小鼠（miR-150KO）和野生型對照 C57BL/6小鼠（WT）由美國Qing-Sheng Mi實驗室惠贈，并在河北聯合大學SPF級小鼠房繁殖、飼養。實驗選取6～10周齡、性別匹配小鼠進行研究。小鼠實驗操作按河北聯合大學實驗動物管理委員會規定進行。miR-150敲除小鼠基因型鑒定采用下列引物:上游:5'-CAAGGACAGGAACCCTTCAGCA-3';下游 5'-CCATGATGCCTGGAAGACATTTC-3'。miR-150KO小鼠產生262 bp片段，WT小鼠產生866 bp片段。

1.1.2 試劑 MirVana miRNA提取試劑盒和Taq-Man MicroRNA檢測試劑盒購自美國Ambion公司。α-半乳糖神經鞘氨醇（α-GalCer）/CD1d四聚體（CD1d-α-Galcer-tetramer）購自日本麒麟公司，抗小鼠TCR-β 抗體（H57-597）、NK1.1 抗體（PK136）、CD44抗體（IM7）、CD3抗體（G4.18）、CD4抗體（RM4-5）、CD8 抗體（53-6.7）、CD25 抗體（PC61）、Biotin標記 CD8抗體、抗 Biotin磁珠購自 BD或eBioscience公司。磁珠分選系統購自美天旎生物技術公司。細胞內染色試劑盒購自eBioscience公司。引物由上海生物工程服務公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細胞分選 分離WT C57BL/6小鼠胸腺細胞，PBS緩沖液重懸（1×PBS;2%FBS;2 mmol/L EDTA）。加入2.4 G2 至 20 μl/107細胞，4℃，30分鐘。采用抗小鼠 TCR-β抗體和CD1d-α-GalCer雙染色，AriaⅡ流式細胞儀（BD）分選胸腺 TCR-β+CD1d-α-GalCer－傳統 T 細胞和 TCR-β+CD1d-α-Gal-Cer+總iNKT細胞。為分選足量不同發育階段iNKT細胞用于后續Real-time PCR分析，WT C57BL/6小鼠胸腺細胞首先與Biotin標記抗小鼠CD8抗體孵育（1μl/107細胞），4℃，10分鐘。加入抗 Biotin磁珠（2μl/107細胞），4℃，15分鐘，PBS洗滌兩次后采用磁珠分選系統剔除小鼠 CD8+胸腺細胞（CD8SP和CD4+CD8+DP）。剩余細胞再采用抗小鼠 TCR-β 抗 體，CD1d-α-GalCer-tetramer、抗 小 鼠NK1.1和抗小鼠CD44抗體染色，流式分選不同發育階段胸腺iNKT細胞。

1.2.2 Real-time PCR 采用Ambion mirVana miRNA提取試劑盒分別提取、純化WT或miR-150KO小鼠胸腺細胞，胸腺傳統T細胞，總iNKT及不同發育階段iNKT細胞miRNA;各組細胞中MiR-150的表達首先采用ABImiR-150反轉錄試劑盒進行反轉錄。PCR擴增及產物熒光檢測采用ABI 7900 Realtime PCR系統進行，同時檢測各組細胞中snoRNU202的表達作為內參照，結果分析采用 ^CT值，并計算miR-150在WT和 miR-150KO小鼠各組細胞以及不同發育階段WT NKT細胞中的相對表達。

1.2.3 流式細胞儀分析 小鼠胸腺細胞首先用含2%小牛血清的PBS染色緩沖液洗滌兩次，加入封閉抗體2.4G2（10μl/106細胞），4℃ 30分鐘，然后直接加入熒光素標記的α-GalCer/CD1d四聚體及其它相關抗體。4℃ 30分鐘。PBS染色緩沖液洗滌2次，1 000轉5 min/次。采用BD-LSRⅡ流式細胞儀收集標本，CellQuest Pro（BD Biosciences）或FlowJo軟件進行數據分析。

1.3 統計學分析 采用GraphPad Prism v5.0軟件進行數據處理和統計分析，結果采用雙尾Student's t檢驗，P＜0.05為組間有統計學差異。

2 結果

2.1 miR-150在iNKT細胞發育過程中表達增加選取 WT C57BL/6小鼠，流式分選胸腺 TCR-β+CD1d-α-GalCer－傳統 T 細胞 和 TCR-β+CD1d-α-GalCer r+iNKT細胞 （圖1A）。提取各組細胞總RNA，采用Real-time PCR檢測miR-150的表達。結果發現miR-150在胸腺傳統T細胞和iNKT細胞中均有表達，但miR-150在傳統T細胞中的表達顯著高于iNKT細胞 （P＜0.01，圖1B）。利用抗CD44和抗NK1.1抗體進一步流式分選Stage 1（CD44－NK1.1－），Stage 2（CD44+NK1.1－）和 Stage 3（CD44+NK1.1+）iNKT細胞，各群細胞分選純度在90%以上（圖1C）。Real-time PCR檢測不同發育階段iNKT中miR-150的表達，發現miR-150在所有發育階段的iNKT細胞中都有表達，但隨著胸腺iNKT細胞的發育成熟，miR-150的表達逐漸增加，并在終末成熟階段Stage 3（CD44+NK1.1+）iNKT細胞中表達最高（圖1D）。

圖1 m iR-150在iNKT細胞發育成熟過程中表達增加Fig.1 Expression ofm iR-150 is upregulated during the development of iNKT cells

圖2 m iR-150敲除不影響胸腺傳統T細胞的發育和成熟Fig.2 m iR-150 knock-out does not affect the development and maturation of general T cells

2.2 MiR-150敲除不影響傳統T細胞發育 為觀察miR-150對小鼠胸腺傳統T細胞和iNKT細胞發育的影響，我們采用 miR-150基因敲除（miR-150KO）小鼠。基因鑒定及Real-time PCR結果顯示:miR-150KO小鼠基因型正確（圖2A），胸腺細胞中miR-150的表達較WT小鼠顯著降低（圖2B）。對WT和miR-150KO小鼠胸腺細胞進行抗-CD4和抗-CD8抗體染色，比較胸腺傳統T細胞各發育階段包括CD4－CD8－（DN），CD4+CD8+（DP），CD4+（SP），CD8+（SP）細胞比率的變化，發現兩組間比較無顯著性差異（圖2C）。細胞計數比較WT和miR-150KO小鼠胸腺細胞數量的變化，兩組間無顯著性差異（圖2D）。早期胸腺傳統T細胞在CD4－CD8－DN階段，經歷 CD44+CD25－（DN1），CD44+CD25+（DN2），CD44－CD25+（DN3）和 CD44－CD25－（DN4）發育為CD4+CD8+DP細胞。通過分析CD44和 CD25在CD4－CD8－DN細胞中的表達變化，發現miR-150KO小鼠早期胸腺傳統T細胞的發育正常（圖2E）。以上結果表明，miR-150基因缺失不影響胸腺傳統T細胞的發育和成熟。

2.3 MiR-150敲除致胸腺iNKT細胞發育和成熟障礙 采用抗-TCR-β抗體和CD1d-α-Galcer染色，流式分析比較miR-150KO小鼠與WT小鼠胸腺iNKT細胞的變化（圖3A），發現與 WT小鼠相比，miR-150KO小鼠胸腺iNKT細胞比例（P＜0.01）和數量（P＜0.05）均顯著降低（圖3B）。與傳統T細胞相似，iNKT細胞在胸腺陽性選擇后，經歷一系列發育階段成為成熟CD44+NK1.1+iNKT細胞。通過抗小鼠 CD44和 NK1.1抗體染色，流式分析 miR-150KO小鼠胸腺iNKT細胞各發育階段的變化（圖3C）。發現與WT小鼠相比，miR-150KO小鼠胸腺成熟NK1.1+CD44+iNKT細胞比率顯著降低（P＜0.01）。而處于中間成熟階段CD44+NK1.1－iNKT細胞比率則顯著增加（P＜0.05），但早期非成熟CD44－NK1.1－iNKT細胞比率與對照組相比沒有變化（圖3D）。細胞數量分析表明:成熟階段CD44+NK1.1+iNKT細胞總數與對照組相比顯著降低（P＜0.01），但 CD44+NK1.1－和非成熟 CD44－NK1.1－iNKT細胞總數與WT小鼠相比，沒有顯著性變化（圖3E）。以上結果表明，MiR-150缺失不但影響胸腺iNKT細胞的發育，而且阻礙其成熟。

3 討論

根據T細胞受體（TCR）的表達差異，NKT主要分為兩型，Ⅰ型NKT細胞表達恒定型TCRα鏈（小鼠:Vα14-Jα18，人:V α24-Jα18）和 Vβ 鏈（小鼠:Vβ8.2，Vβ7，Vβ2，人:Vβ11），因此又稱為恒定型NKT細胞（iNKT）。iNKT細胞能被CD1d四聚體荷載的半乳糖酰基鞘氨醇（α-GalCer-CD1dtetramers）特異性識別。Ⅱ型NKT細胞表達多樣性TCRα鏈，但由于缺乏特異的識別試劑而研究較少［8］。

圖3 m iR-150敲除小鼠胸腺iNKT細胞發育和成熟缺陷Fig.3 Defective iNKT cell development and maturation in m iR-150KO m ice

來自骨髓的T細胞前體細胞進入胸腺后，經歷CD4－CD8－DN、CD4+CD8+DP 階段后發育為成熟的CD4+SP和CD8+SP T細胞，然后進入外周并在一定細胞因子環境下分化為Th1、Th2等具有特異細胞因子分泌功能的輔助性T細胞亞群。同CD4+和CD8+T細胞一樣，iNKT細胞也是一個胸腺依賴的T細胞亞群。iNKT細胞起源于胸腺CD4+CD8+DP T細胞。其前體細胞識別周圍CD4+CD8+DP T細胞上由CD1d呈遞的鞘糖脂類抗原，經歷一系列的發育和成熟過程后成為具有多種細胞因子分泌功能的 iNKT細胞，成熟的小鼠 iNKT細胞表現為CD4+或CD4－CD8－，而人iNKT細胞表現為CD4+、CD8+或 CD4－CD8－［5］。

microRNAs作為一種轉錄后調控機制在造血細胞中呈發育階段和細胞特異性表達［9］。Dicer是一種RNA酶，在幾乎全部microRNAs的生成過程中發揮關鍵所用［10］。采用lck啟動子驅動的Cre酶在T細胞發育早期階段（CD4－CD8－DN）刪除Dicer導致胸腺傳統αβT細胞顯著下降，而采用CD4啟動子驅動的Cre酶在T細胞發育晚期刪除Dicer則導致αβT細胞輕微下降但向 Th1型細胞分化增加［11，12］。同時，Zhou 等［13］發現 Dicer 敲除小鼠胸腺iNKT細胞發育和成熟受阻，細胞數量顯著降低。以上研究表明:microRNAs作為一個整體在胸腺CD4+、CD8+傳統T細胞和iNKT細胞的發育和成熟中發揮重要作用。然而，特異microRNA在胸腺傳統T細胞和iNKT細胞的發育和成熟中的作用目前所知甚少。在此研究中我們發現，雖然胸腺iNKT細胞和傳統胸腺T細胞均表達miR-150，且miR-150在傳統T細胞中的表達高于iNKT細胞，但miR-150敲除并不影響CD4+和CD8+傳統T細胞的發育、成熟和CD4－CD8－DN T細胞的早期發育。相反，miR-150敲除導致胸腺iNKT細胞細胞數目減少，發育阻滯在終末成熟階段。

miR-150已被鑒定為在淋巴細胞特異表達的microRNA［14］。與在iNKT細胞發育過程中的表達模式相似，miR-150在 T、B細胞的發育成熟過程中表達顯著增加［7，15］。Zhou 等［7］的研究表明:過表達miR-150對CD4+SP和CD8+SP細胞的產生沒有影響，而成熟B細胞的產生顯著減少，細胞的發育阻滯在祖B細胞向前B細胞的過度階段。有意思的是，最近Bezman等［16］在野生型（WT）-miR-150混合骨髓移植嵌合體小鼠模型中發現:miR-150敲除胸腺iNKT細胞的數量較WT來源的iNKT細胞有輕微程度的下降（1.5±0.2倍），其細胞下降的主要部分為成熟CD44+NK1.1+iNKT細胞，雖然該研究結果與我們的實驗結果相符，但是，Bezman等沒有檢測到這一降低具有統計學意義。可能的原因在于:（1）實驗系統不同，我們采用的是miR-150敲除小鼠模型，而Bezman等采用是小鼠混合骨髓移植模型;（2）與Dicer敲除丟失幾乎所有microRNAs相比，miR-150基因單獨敲除引起的胸腺iNKT細胞數量降低和發育障礙并不十分顯著，而在Bezman等的骨髓移植實驗中，每個實驗組3到4只小鼠可能不足以檢測出這一差異。同時也提示，除miR-150外，可能還有多個未知的特異miRNAs調控iNKT細胞的發育和成熟。

總之，以上實驗結果說明:雖然miR-150在胸腺傳統T細胞和iNKT細胞中均有表達，且miR-150隨二者的發育、成熟表達增加，但miR-150缺失并不影響胸腺傳統T細胞的發育，而導致胸腺iNKT細胞數量降低，且發育主要阻滯在終末成熟階段（從CD44+NK1.1－到 CD44+NK1.1+）。因此，miR-150特異地調控胸腺iNKT細胞的發育和成熟。而miR-150在傳統T細胞中的作用以及對iNKT細胞功能的影響仍需進一步探討。

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［收稿2012-08-21 修回2012-09-10］

（編輯 張曉舟）

MiR-150 specifically regulates the development and maturation of invariant NKT cells

ZHENGQuan-Hui，ZHANGAi-Hong，ZHENGAi-Hua，LUBin，ZHANGQing-Bo，HOUZhi-Hong，LIJuan，CHENShu-Yuan.CollegeofBasicMedicalScience，HebeiUnitedUniversity，Tangshan063000，China

Objective:To explore the role ofmiR-150 in the developmentandmaturation of general thymus T cells and invariant NKT cell（iNKT）.Methods:Expression ofmiR-150 was detected by Real-time PCR.The quantity and phenotype changes of thymus general T cells and iNKT cells in miR-150 knock outmice were detected by flow cytometry.Results:miR-150 expressed in both general thymus T cells and iNKT cells，and expression ofmiR-150 increased gradually during the developmentandmaturation of iNKT cells.Deletion ofmiR-150 did not affect the development of general T cells but resulted in the decreased number and developmental defect of iNKT cells.Conclusion:miR-150 specially regulates the development and maturation of thymus iNKT cell in mice.

miR-150;Gene knock-out;T cell;iNKT cell

R392.11

A

1000-484X（2013）02-0130-06

10.3969/j.issn.1000-484X.2013.02.004

①河北省唐山市工人醫院，唐山063000

②河北省唐山市人民醫院，唐山063000

鄭全輝（1973年－），男，博士，講師，主要從事NKT細胞發育和功能的分子調控機制方面的研究，E-mail:zquanhui@yahoo.com。