siRNA干擾沉默HOXA9基因?qū)毙园籽562細胞凋亡的影響

熊茂來 (湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院，恩施445000)

白血病是一種發(fā)生于造血組織的惡性疾病，其特點是某一類型白血病細胞在骨髓組織或其他造血組織中呈腫瘤性增生。白血病發(fā)病率占兒童惡性腫瘤的第一位。在我國白血病的患者30%是兒童。急性髓系白血病 (Acute myeloid leukemia，AML)約占兒童急性白血病的20%，過去20年，5年生存率已上升至60%[1]。目前，化療是治療兒童白血病的主要方式，但復(fù)發(fā)、耐藥等問題還有待解決，如何從分子水平進行靶向治療提高療效是近年來研究的熱點。

HOXA9(Homo sapiens homeobox A9)基因?qū)儆诟叨缺Ｊ赝春谢蚣易宓囊粏T，廣泛存在于果蠅、老鼠和人體內(nèi)，與胚胎體節(jié)發(fā)育和形態(tài)發(fā)生密切相關(guān)。據(jù)報道，HOXA9基因在80%AML患者中表達上調(diào)，是導(dǎo)致傳統(tǒng)治療失敗的獨立影響因素[2]。在白血病模型中，HOXA9基因的過表達，對抑制骨髓細胞的分化起了重要作用，使骨髓細胞停留在原始狀態(tài)[3]。因此，HOXA9基因有可能成為AML的分子治療靶點。本實驗通過siRNA靶向沉默HOXA9基因表達，探討其對白血病K562細胞系的生物學(xué)影響，為進一步研究其基因治療價值，提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑 K562細胞(購自中科院上海生化與細胞研究所);RPMI1640培養(yǎng)液和胎牛血清購自美國HyClone公司;2×SYBER GREEN Mix購自TOYOBO公司;Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒購自碧云天;Lipofectamine 2000、TRIZOL購自 Invitrogen公司;Anti-HOXA9購自博士德公司;HOXA9-siRNA由上海吉瑪公司設(shè)計合成。

1.2 試驗方法

1.2.1 實驗分組和細胞培養(yǎng) 實驗分未處理組、siRNA陰性對照組、HOXA9-siRNA組。K562細胞采用 RPMI1640培養(yǎng)基，含10%胎牛血清，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 設(shè)計合成HOXA9-siRNA 根據(jù)HOXA9在GeneBank中的序列，設(shè)計靶向HOXA9的siRNA序列5'-CCACGCACTGTGTTTCCTT-3'，陰性 siRNA 序列5'-GGACCTGTATGCGTACATT-3'，由上海吉瑪公司合成。

1.2.3 細胞轉(zhuǎn)染 參照Lipofectamine 2000說明書操作，12孔板中每孔K562細胞密度約為4×105個細胞，每孔轉(zhuǎn)2 μg質(zhì)粒。

1.2.4 細胞總RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄 收集轉(zhuǎn)染后48小時細胞，用 TRIZOL一步法提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄參照Fermentas逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作。

1.2.5 Real time PCR SYBER Green法檢測各組HOXA9 mRNA水平 以 GAPDH為內(nèi)參，以2-△△CT法分析各樣本CT值。HOXA9上游引物5'-GTCCCACGCTTGACACTC-3'，下游引物 5'-GTTGGCTGCTGGGTTATT-3';GAPDH上游引物5'-GGTATCGTGGAAGGACCATGAC-3'，下游引物 5'-ATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCAGC-3';引物由上海生工合成。

1.2.6 Western blot 收集轉(zhuǎn)染后72小時細胞，用RIPA裂解液裂解，于 12%SDS-PAGE電泳，按1∶1 000比例稀釋一抗，4℃孵育過夜，HRP標記二抗室溫孵育1小時，ECL法顯色。

1.2.7 細胞凋亡檢測 分別收集轉(zhuǎn)染后24、48、72小時細胞，PBS沖洗兩次，每份樣本加 200 μl Annexin V-FITC 結(jié)合液、5 μl Annexin V、5 μl PI避光孵育15分鐘后進行流式細胞學(xué)檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS10.0統(tǒng)計軟件，t檢驗統(tǒng)計學(xué)處理，數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，檢驗水準:α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 HOXA9-siRNA對K562細胞HOXA9 mRNA水平的影響 Real time PCR法檢測K562細胞轉(zhuǎn)染后HOXA9基因mRNA水平改變，結(jié)果見圖1。

圖1 HOXA9-siRNA對K562細胞HOXA9 mRNA表達的影響Fig．1 Effect of HOXA9-siRNA on HOXA9 mRNA level in K562 cells

圖2 HOXA9-siRNA對K562細胞HOXA9蛋白表達的影響Fig．2 Effect of HOXA9-siRNA on HOXA9 protein level in K562 cells

2.2 HOXA9-siRNA對K562細胞HOXA9蛋白水平影響 Western blot檢測轉(zhuǎn)染后HOXA9蛋白水平變化，結(jié)果見圖2。

2.3 HOXA9-siRNA對K562細胞凋亡率的影響流式細胞學(xué)檢測細胞凋亡，結(jié)果見圖3、表1。

3 討論

圖3 HOXA9-siRNA對K562細胞凋亡的影響Fig．3 Effect of HOXA9-siRNA on K562 cells apoptosis

表1 各組凋亡率變化Tab．1 Apoptosis of three groups

越來越多的證據(jù)表明Hox基因家族在造血生長調(diào)控中起到重要作用[4]。在老鼠骨髓細胞中，HOXA9的過表達在3～8個月內(nèi)導(dǎo)致AML，表明其是先于AML發(fā)生，HOXA9的過表達成為與預(yù)后不良相關(guān)的獨立因素[2]。轉(zhuǎn)進HOXA9的轉(zhuǎn)基因小鼠，與對照組相比，移植入的淋巴髓系細胞長期存活數(shù)量增加了15倍，表明HOXA9在促進造血干細胞生長中的作用[5]。HOXA9在混合系白血病中表達胞、γδT淋巴細胞等，因此推斷干酪乳桿菌EPS可能具有調(diào)控IL-17主要分泌細胞的能力。

研究結(jié)果初步表明，干酪乳桿菌EPS可體外促進腸相關(guān)組織中淋巴細胞增殖和調(diào)節(jié)相關(guān)細胞因子TNF-α、IL-17的分泌，初步推斷干酪乳桿菌EPS具有調(diào)節(jié)腸相關(guān)淋巴組織淋巴細胞免疫活性的能力，能夠改善腸黏膜免疫系統(tǒng)。但EPS通過口服途徑到達腸道，以大分子形式接觸腸相關(guān)淋巴細胞后，是否仍具有與體外實驗相符的功能仍需進一步證實。

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