神經組織工程修復脊髓損傷的研究進展（天然生物支架修復脊髓損傷）

馬犇，彭寶淦

（1.徐州醫學院，江蘇 徐州 221004；2.武警總醫院，北京 100039）

脊髓損傷（Spinal Cord Injury SCI）是一種以脊髓損傷平面以下感覺運動功能喪失、大小便失禁、性功能障礙為主要臨床表現的中樞神經系統疾病，臨床上以創傷引起的脊髓損傷常見。脊髓損傷的康復是當今仍未解決的醫學難題，究其原因是人類中樞神經只具有極其微弱的再生能力，多種病理生理活動及多種代謝產物參與導致損傷部位的微環境變化，不利于神經軸突的再生長造成。

近年采用細胞移植、組織工程、轉基因技術等治療方法修復脊髓損傷，取得了一定進展。這些研究在促進損傷神經再生能力及改變脊髓損傷部位的微環境做了嘗試，其中神經組織工程技術的發展，在修復脊髓損傷，促進功能康復取得了較大的進步。神經組織工程是以支架為載體載入種子細胞進入損傷部位或植入新的組織，以達到修復損傷的神經組織的目的。種子細胞目前報道有神經干細胞、嗅鞘細胞、許旺細胞、胚胎干細胞、骨髓基質干細胞等[1-3]。支架是神經組織工程里不可或缺主體，其主要作用能橋接損傷的脊髓，為脊髓中神經軸突生長橋接提供空間和營養，還能作為種子細胞移植治療神經損傷的土壤，引導細胞的生長、增殖、分化、遷移以及凋亡，從而促進脊髓神經的再生。完美的支架應該具備良好的生物相容性及支架降解產物無毒性，良好的機械支撐力，適合軸突生長的孔隙率及三維立體的空隙結構，良好的可塑性及粘附力[4]。作為細胞移植的載體，按構成支架的材料的屬性可以將支架分為天然生物支架（天然生物材料是在自然條件下生成的生物材料，主要包括天然纖維、生物體組織、結構蛋白和生物礦物等材料[3]），人工材料合成支架（相對于“天然材料”而言。自然界以化合物形式存在的、不能直接使用的，或者自然界不存在的，需要經過人為加工或合成后才能使用的材料[1-4]），及復合型支架（基于天然材料和人工材料混合而成的支架）3大類。天然生物支架因具有與宿主的良好的生物相容性、降解產物無毒性及良好的粘附力成為研究的熱點，去細胞組織支架作為天然生物支架重要分支，在細胞信號識別，促進細胞的粘附、增殖和分化等方面有獨特優勢，現就天然生物支架修復脊髓損傷的應用進行綜述。

1 天然生物材料合成支架在脊髓損傷修復中的研究

天然生物材料，主要包括天然纖維、生物體組織、結構蛋白和生物礦物等材料[3]。天然生物支架包括基于天然材料合成的支架、天然的組織及天然組織的衍生支架。天然生物材料合成支架常是運用天然生物材料合成的天然可降解的管狀，或者打印成條狀通道結構的高孔隙率的支架。天然材料有透明質酸、膠原、纖維蛋白、藻酸鹽、殼聚糖、聚羥基丁酸酯及甲基纖維素水凝膠等，他們既可以單獨作為支架，也可以作為天然材料合成支架。因而這些天然材料及其合成的天然生物支架具有良好的生物相容性、細胞親和性和可降解性，且降解產物無毒性，能較好地促進細胞黏附、增殖[3，4]。

透明質酸廣泛存在與細胞外組織間隙中，可以很大程度減少損傷部位的淋巴細胞遷移及分化，阻止其炎癥趨向性，能阻止炎癥細胞的吞噬作用而達到減輕脊髓損傷的二次損傷，促進創傷后的脊髓神經組織再生[5，6]。然而透明質酸制成的支架對種子細胞的粘附能力較弱，這在近期的研究中的到改善，有學者將層粘連蛋白Laminin（LA）加入透明質酸制成支架，或者在支架上涂上賴氨酸涂層[7]，使其粘連能力得到很大改善。然而由于透明質酸支架的支撐強度較弱，以及其很高的降解率沒有得到改善，現已較少運用到脊髓損傷的修復。

膠原（collagen）是人體和脊椎動物的主要結構蛋白，作為重要的細胞外基質（Extracellular Matrix，ECM）成分，具有細胞黏附信號的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸基因序列，從而促進種子細胞在支架上得黏附、促進種子細胞的分化及遷移，機體的軸突有利于附著在膠原支架上從而有利于軸突的再生[8]。在脊髓損傷部位膠原還可攜帶生長因子參與調節局部微環境和減少瘢痕組織形成，有利于損傷的恢復[9]。但這些再生的神經纖維是雜亂無章的，膠原制成的支架不能引導再生的纖維通過損傷部位而達到尾端組織而形成完整的神經通路[10]，也有文獻報道在損傷部位過高膠原濃度，會阻礙神經軸突的生長[11]。

其他用于制成支架修復脊髓損傷的天然材料還包括藻酸鹽、殼聚糖及水凝膠等，還有一些基于蛋白：如纖維素蛋白的合成支架也被嘗試用于修復脊髓損傷[12，13]。這些研究顯示基于天然材料合成的支架相比于人工材料合成的支架有提高種子細胞的粘附能力，良好地生物相容性及降解無毒性，延長種子細胞的體內存活時間，提高種子細胞向神經細胞的分化率，較好的促進組織再生及功能康復等優勢[1]。有些學者發現原始材料直接用于修復時機械支撐力弱，不能引導再生的神經組織有效通過損傷區，降解速率與機體康復不同步等缺陷[1，13]，如果以天然材料重新塑形，合成支架也會面臨支架硬度，降解度不匹配組織修復的進度，且孔隙率很難完全匹配神經軸突的再生長。面對這些問題，天然材料合成的支架要修復脊髓損傷還需要很多改進。

2 去細胞組織支架修復脊髓損傷的優勢

綜上所述，基于天然材料合成支架存在不同程度的缺陷，不能很好解決脊髓損傷的修復問題。近年來去細胞組織支架成為人們研究的熱點，去細胞支架是生物組織經人工萃取及去細胞等處理而來的的天然組織支架，被廣泛的用于天然生物材料合成支架的替代而用于組織修復研究中[1-4]。去細胞組織支架因具備天然組織及天然生物原料及其合成支架的優點，同時也具備高仿真三維立體結構，對損傷部位的機械支撐力適中，降解率匹配組織再生修復速率等優勢，現已成為近期研究的熱點。將組織中的細胞蛋白質等物質用化學方法去除，得到無抗原的天然的去細胞組織支架，這些支架具備生物相容性好，免疫原性低，且制作方便，移植到體內能為種子細胞提供盡可能接近體內環境的生長空間[1-4]。去細胞組織技術在皮膚病、泌尿系統損傷，消化疾病，心血管疾病、呼吸系統疾病，肌肉等組織修復方面已有廣泛應用[1-4，14-16]。

Sondell等17于1998年率先報道了用大鼠的去細胞坐骨神經支架修復坐骨神經損傷，取得了不錯的效果。新鮮的坐骨神經被取下后，采用Triton X-100和脫氧膽酸鈉化學萃取的方式去除掉坐骨神經組織中的細胞等成分，剩下纖維骨架及基膜組織，電鏡掃描下可以看到神經細胞被萃取，剩下疏松的多孔的三維立體結構支架。將此支架移植入體內，20天后，相比于移植未萃取的組織對照組，萃取組可觀察到大量的微血管及神經軸突通過損傷區，運動功能得到明顯改善。Hudson和Rovak等在隨后的嚙齒動物模型上使用的大量的去細胞神經異體組織移植的實驗中證明其移植后幾乎不引起免疫排斥反應[18，19]。Hu 等[20]采用去細胞處理同種異體神經復合骨髓基質干細胞修復靈長類動物長節段尺神經缺損，術后6個月，修復效果與自體移植相似。

在中樞神經系統損傷中，常常因為中樞損傷得不到有效的修復而造成永久的功能喪失。人工材料合成的支架由于降解物的毒副作用而讓研究者望而卻步，基于天然材料合成的支架也或多或少存在缺陷。Ribatti等[21]將SD大鼠腦組織去細胞處理后植入雞胚絨毛膜尿囊膜結果顯示能明顯促進血管新生，并且沒有發現炎細胞浸潤。脊髓細胞構成和大腦相似，由此，此研究為去細胞組織支架修復中樞神經系統損傷提供了理論支持。

Guo等[22]率先報道了去細胞脊髓組織支架的研究工作，采取Sondell萃取組織細胞方法并加以改進，將脊髓組織凍融，再采用改良的化學萃取法制作去細胞脊髓組織支架。支架外觀結構和正常脊髓形狀相似，呈半透明絨毛狀，組織支架內神經軸突及輔助細胞成功萃取掉，剩下高孔隙率的三維立體的疏松孔道狀結構的支架，經其測量空隙直徑為6-150 um，孔隙率高達90%以上，其平面結構由不同大小的空隙縱向平行或不規則排列成孔道樣，并相互慣通，具有高度的仿真性，此結構能為神經軸突的再生提供天然的引導，再生的神經從而可以有效的通過損傷區，達到尾端，為再生的神經與尾端神經組織的耦合提供了條件。該研究還提示去細胞脊髓組織支架具有良好的生物相容性，免疫原性極弱。通過同種異體組織支架移植的對比研究發現，移植支架組未見免疫排斥反應。該文章分析，免疫排斥反應物質主要來源于主要組織相容性抗原復合物（Major Histocompatibility Complex，MHC），其主要存在于細胞膜表面及神經軸突的髓鞘成分，去細胞脊髓組織支架經過萃取的過程，組織內無細胞髓鞘等殘留。Liu等[23]做了更進一步的研究，其采用去細胞脊髓組織支架復合人臍血干細胞修復SD大鼠脊髓損傷，取得了不錯的效果。在該研究中，馬松三色染色結果顯示支架由主要成分為膠原。去細胞脊髓組織支架表現出較好的粘附力，細胞支架在體外聯合培養時，細胞可均勻分布在支架內。移植入體內后，三維立體結構使部分種子細胞可以在組織及正常組織內自由的遷移，種子細胞可分化為星形膠質細胞及少突膠質細胞，并釋放促軸突再生的生長因子，促進軸突的再生，引導再生的軸突通過損傷區，與尾端組織相連。支架復合細胞移植入體內還使鄰近損傷部位的受損神經軸突的凋亡及軸突的髓鞘空泡化變減輕。該研究提示去細胞脊髓組織支架復合干細胞不僅可以促進神經軸突的再生，還能保護鄰近損傷的神經，達到了修復脊髓損傷，促進功能的恢復。

近來，Zhang等[24]還嘗試采用肌肉組織去細胞支架來修復脊髓損傷，并取得一定的進展。分析去細胞肌肉支架，構成支架的膠原纖維的三維空間結構與去細胞脊髓支架相似，該研究還顯示了去細胞肌肉組織支架的理化性質和去細胞脊髓支架類同，都具有良好地生物相容性及低免疫原性，較高的孔隙率及三維立體網狀結構，生物降解率和脊髓修復時間相匹配等優點。移植后8周可明顯觀察到大量的軸突長入支架內，并在支架的引導下通過損傷區，并獲得良好地功能恢復。相比于去細胞脊髓組織支架，去細胞組織支架還具有取材方便，可自體移植等優點。

綜上所述，組織工程技術在移植材料、支架制備技術等方面的迅速發展已經為脊髓損傷后神經功能的修復展現了廣闊的前景，但仍然有些問題未得到解決。人工材料合成的生物組織支架因其本身不可改變的屬性往往使其和細胞親和粘附性不佳、降解速率不確定及降解產物有毒、孔隙率及三維立體結構很難把握而限制了其運用，大有被天然生物材料取代的趨勢。天然的生物支架材料有較低的免疫原性，對細胞有較好的粘附力，還能包被目的生長因子在支架內，從而促進種子細胞的存活時間，并促進種子細胞的分化等優勢，但天然生物材料的機械強度不高，降解率不能匹配組織再生修復的速率，而基于天然材料合成的支架又受限于制作工藝不高，較難按設想加工塑形的局限，很難達到理想支架的狀態，故還需要更多的研究來改進。與之相較，將去細胞組織支架尤其是去細胞脊髓組織支架作為脊髓損傷修復的組織工程支架具有許多獨特優勢：支架來源于天然組織，因此具備天然材料支架的屬性；其孔隙率及天然的三維立體網狀結構有利于種子細胞的存活及分化，并有利于軸突的再生長，并引導軸突通過損傷區；其機械強度及生物支撐度和脊髓相似，能滿足損傷區的支撐需求。因此，去細胞組織支架是現階段修復脊髓損傷的最好選擇。神經去細胞組織工程技術的發展復合日漸成熟的藥物緩釋技術，將推動中樞神經損傷的修復再上新臺階。

[1] Sakiyama-Elbert S，Johnson PJ，Hodgetts SI，et al.Scaffolds to promote spinal cord regeneration[J].Handb Clin Neurol，2012，109：575-594.

[2] Wang M，Zhai P，Chen X，et al.Bioengineered scaffolds for spinal cord repair[J].Tissue Engineering Part B Rev，2011，17（3）：177-194.

[3] Madigan NN，McMahon S，O'Brien T，et al.Current tissue engineering and novel therapeutic approaches to axonal regeneration following spinal cord injury using polymer scaffolds[J].Respir Physiol Neurobiol，2009，169 （2）：183-199.

[4] Potter W，Kalil RE，Kao WJ.Biomimetic material systems for neural progenitor cell-based therapy[J].Front Biosci，2008，1；（13）：806-821.

[5] Burd DA，Greco RM，Regauer S，et al.Hyaluronan and wound healing：a new perspective[J].Br JPlast Surg，1991，44（8）：579-584.

[6] Ozgenel GY.Effects of hyaluronic acid on peripheral nerve scarring and regeneration in rats[J].Microsurgery，2003，23（6）：575-581.

[7] TianWM，Hou SP，Ma J，etal.Hyaluronic acidp oly-D-lysine-based three-dimensional hydrogel for traumaticbrain injury[J].Tissue Eng，2005，1（3-4）：513-525.

[8] Onose G，Anghelescu A，Muresanu DF，Padure L，et al.A review of published reports on neuroprotection in spinal cord injury[J].Spinal Cord，2009，47（10）：716-726.

[9] Klapka N，Muller HW.Collagen matrix in spinal cord injury[J].J Neurotrauma，2006，23（3-4）：422-435.

[10] Houweling DA，Lankhorst AJ.Collagen containing neurotrophin-3（NT-3）attracts regrowing injured corticospinal axons in the adult rat spinal cord and promotes partial functional recovery[J].Exp Neurol，1998，153（1）：49-59.

[11] Perale G，Rossi F，Sundstrom E，et al.Hydrogels in spinal cord injury repair strategies[J].ACS Chem Neurosci，2011，2（7）：336-345.

[12] Nisbet DR，Crompton KE，Horne MK，et al.Neural tissue engineering of the CNS using hydrogels[J].JBiomed Mater Res B Appl Biomater，2008，87（1）：251-263.

[13] Samadikuchaksaraei A.An overview of tissue engineering approaches for management of spinal cord injuries[J].J Neuroeng Rehabil，2007，14（4）：15.

[14] Pahari MP，Raman A，Bloomenthal A，et al.A novel approach for intestinal elongation using acellular dermal matrix：An experimental study in rats[J].Transplant Proc，2006，38（6）：1849-1850.

[15 Knight RL，Wilcox HE，Korossis SA，et al.The use of acellular matrices for the tissue engineering of cardiac valves[J].Proc Inst Mech Eng H，2008，222（1）：129-143.

[16] Ott HC，Matthiesen TS，Goh SK，et al.Perfusion decellularized matrix：Using nature’s platform to engineer a bioartificial heart[J].Nat Med，2008，14（2）：213-221.

[17] Sondell M，Lundborg G，Kanje M.Regeneration of the rat sciatic nerve into allografts made acellular through chemical extraction[J].Brain Res，1998，795（1-2）：44-54.

[18] Hudson TW，Zawko S，Deister C，et al.Optimized acellular nerve graft is immunologically tolerated and supports regeneration[J].Tissue Eng，2004，10（9-10）：1346-1358.

[19] Rovak JM，Bishop DK，Boxer LK，et al.Peripheral nerve transplantation：the role of chemical acellularization in eliminating allograft antigenicity[J].J Reconstr Microsurg，2005，21（3）：207-213.

[20] Hu J，Zhu QT，Liu XL，et al.Repair of extended peripheral nerve lesions in rhesus monkeys using acellular allogenic nerve grafts implanted with autologous mesenchymal stem cells[J].Exp Neurol，2007，204（2）：658-666.

[21] Ribatti D，Conconi MT，Nico B，et al.Angiogenic response induced by acellular brain scaffolds grafted onto the chick embryo chorioallantoic membrane[J].Brain Res，2003，989（1）：9-15.

[22] Guo SZ，Ren XJ，Wu B，et al.Preparation of the acellular scaffold of the spinal cord and the study of biocompatibility[J].Spinal Cord，2010，48（7）：576-581.

[23] Liu J，Chen J，Liu B，et al.Acellular spinal cord scaffold seeded with mesenchymal stem cells promotes long-distance axon regeneration and functional recovery in spinal cord injured rats[J].JNeurol Sci，2013，325（1-2）：127-136.

[24] Zhang XY，Xue H，Liu JM，et al.Chemically extracted acellularmuscle：a new potential scaffold for spinal cord injury repai[J].JBiomed Mater Res A，2012，100（3）：578-587.