阿爾茨海默病相關生物標志物的研究現狀及進展

李錫海，于明，吳金美*

(1.江蘇科技大學生物技術學院，江蘇 鎮江212003;2.江蘇大學附屬醫院神經內科，江蘇 鎮江212001)

阿爾茨海默病(Alzheimer＇sdisease，AD)是一種中樞神經系統常見的、進行性神經退行性疾病，主要病理特征為腦神經細胞外老年斑(senile plaques，SP)和腦神經細胞內神經纖維纏結(neurofibrillary tangles，NFTs)。AD 的發病機制非常復雜，迄今尚未完全明確。普遍認為AD 為多因素影響的綜合征，患者的年齡和家族史為最大致病危險因素。

AD 經由癥狀前AD、輕度認知功能障礙(mild cognitive impairment，MCI)逐步發展成。AD 患者的分子病理學改變先于認知功能損害數年甚至數十年，因此，在人體中及早發現典型的AD 樣病理物質是早期診斷AD 的關鍵。臨床上診斷AD 主要借助病史、神經心理鑒定以及排除其他癡呆類型等，但上述方法的特異性和靈敏度都不高。所以，尋找靈敏度高和特異性強的AD 生物學標志物并應用于臨床診斷就顯得尤為重要。

1 與AD 相關的主要生物標志物

1.1 淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)與β-淀粉樣蛋白(amyloid beta，Aβ)

APP基因位于21q21.1 ～21.3，約為300 kb，含有19 個外顯子。由該基因編碼的蛋白——APP，經β-分泌酶和γ-分泌酶水解生成Aβ 片段，后者是AD患者腦中SP 的主要成分。體內外實驗證實，Aβ 具有很強的神經毒性，可以誘導細胞凋亡。AD 的發生與Aβ 的過度生成及在腦內大量沉淀、堆積有關。Aβ 是各種因素誘發AD 的共同通路，是AD 形成和發展的關鍵因素。Aβ 主要有2種形式，一種是由40 個氨基酸殘基組成的蛋白片段，稱之為Aβ40，另一種是由42 ～43 個氨基酸殘基組成的蛋白片段，稱為Aβ42。研究發現，Aβ42比Aβ40多2 個疏水性氨基酸而具有更高的凝聚能力，更容易在AD 患者的腦中形成SP。

1.1.1 腦脊液中的Aβ 早期對Aβ40的定量檢測結果并不理想，大部分研究顯示，AD 患者腦脊液中Aβ40的水平往往不變或輕度升高［1]。另有研究表明，由于Aβ 寡聚化造成的抗原表位被掩蓋或Aβ 結合了載體蛋白，導致ELISA 等方法無法檢測到Aβ40水平的真實變化，只有使用金屬離子親和層析法才能檢測到腦脊液中Aβ40水平的顯著升高［2]。

大多數研究表明，與健康對照組相比，AD 患者早期腦脊液中Aβ42濃度降低約50%，甚至在MCI 階段就可以見到Aβ42濃度的降低，因此，對AD 患者進行腦脊液Aβ42定量檢測有助于AD 的早期診斷［3]。雖然腦脊液中Aβ42水平的降低可以將AD 患者與健康對照組正確區分開，但是，Aβ42水平的降低并不能將AD 與腦內具有Aβ 沉積的其他疾病區分開，如路易體癡呆、額顳葉癡呆和血管性癡呆等［4]。因此，將Aβ42作為AD 生物標志物，其特異性并不高。腦脊液中Aβ42水平降低的確切原因尚有待于進一步研究。

研究證實，AD 或MCI 患者腦脊液中Aβ40/Aβ42的比值較健康對照組明顯升高，該指標與上述AD患者早期腦脊液Aβ42濃度降低約50%聯合應用可以將AD 和非AD 型癡呆很好地鑒別開，對AD 的早期診斷更具有臨床價值。Kanai 等［5]和Wiltfang等［6]研究也都證實了這一結論，即在預測MCI 發展成為AD 方面，Aβ40/Aβ42的比值比單獨檢測Aβ42水平更有意義。

1.1.2 血液中的Aβ 由于血液標本易采集，故針對血液中AD 的生物標志物研究較多。對于AD 患者血漿中Aβ40和Aβ42水平的檢測，其結果也不盡相同。部分研究發現，AD 患者血漿Aβ40水平顯著高于對照組［7];另有研究表明，在臨床前期，AD 患者血漿中Aβ42濃度明顯降低［8];然而，大多數研究表明，AD 患者早期階段血漿中Aβ40和Aβ42并無明顯變化，故血漿Aβ40和Aβ42水平的檢測對AD 的早期診斷并無意義［9]。彭丹濤等［10]研究證實，家族性AD 患者血漿Aβ42水平較對照組顯著升高，隨著疾病的進展，Aβ42水平逐漸降低，因此，Aβ42水平的變化要早于臨床癥狀的發生;而血漿中Aβ40水平與對照組比較，差異無統計學意義。這些實驗結果的不同可能與血漿中Aβ 水平較低、影響血漿Aβ 代謝的肝腎功能及影響血漿Aβ 來源的外周組織(如骨骼肌可產生Aβ)有關。因此，血液中Aβ 水平作為AD早期診斷的生物標志物缺乏足夠的穩定性和可靠性，對AD 的臨床診斷缺乏應用價值。研究發現，由Aβ42聚集形成的可溶性Aβ 寡聚體是產生神經毒性的主要形式［11]。Aβ 寡聚體能夠特異地與某些突觸相結合，進而引起突觸結構損傷和認知功能障礙。值得注意的是，這種損害在AD 的早期階段就已經出現，因此，對可溶性Aβ 寡聚體的檢測可能更具有臨床診斷意義。

鑒于AD 患者腦內有Aβ 的沉積，推測AD 患者可能存在清除Aβ 的免疫缺陷，因此，針對抗Aβ 自身抗體也有大量的研究。研究顯示，AD 患者血清中抗Aβ 自身抗體的水平較健康對照組明顯升高［12-13]。Marcello 等［14]分析AD 患者與健康對照組外周血中不同Aβ 亞型(Aβ1-42、Aβx-40、Aβx-42和AβpE3)的抗Aβ 抗體，結果顯示，兩組除抗AβpE3 抗體有差異外，其他并無明顯差異。另有研究發現，抗Aβ 寡聚體抗體在中重度患者中的水平顯著高于輕度AD 患者［15]，提示其可用于AD 疾病進程的診斷。目前，關于AD 患者血漿中抗Aβ 自身抗體的變化仍有爭議，仍需更深入地進行研究。

1.1.3 血小板中的APP 在血小板中，完整的APP被加工成3種異構體，相對分子質量分別為130000、110000和106000。研究顯示，APP 異構體的代謝變化與AD 的發病過程有著重要相關性［16]。Mukaetova-Ladinska 等［17]對血小板中的APP 進行檢測，發現其含量與認知程度呈負相關。高分子量的APP 異構體(130000)與低分子質量的異構體(110000 與106000 之和)的比值稱為APP 異構體比值。研究表明，AD 患者血小板中該比值低于健康對照組，并且與疾病的嚴重程度和進程存在著一定的關聯，該比值可以作為AD 的有效生物標志物［18-19]。

1.2 tau 蛋白

tau 蛋白是一種微管相關蛋白，起到促進微管形成、穩定神經元的作用。在AD 患者腦內，tau 蛋白發生異常磷酸化、糖基化后形成配對螺旋纖維(paired helical filaments，PHFs)，進一步形成NFTs。

在NFTs 形成早期，總tau 蛋白(total tau proteins，t-tau)和水溶性磷酸化tau 蛋白(phosphorylated tau proteins，p-tau)可以通過病變神經元的細胞膜進入腦脊液中。研究顯示，中重度AD 患者腦脊液中t-tau 水平較健康對照組高2 ～3 倍［20];雖有研究發現t-tau 升高水平與疾病進程無關，但在AD 發病早期就檢測到t-tau 的升高［21-22]，因此，t-tau 可以用于AD 的預測。然而Gloeckner 等［23]對106例包括AD、皮質-脊髓-紋狀體變性、Lewy 癡呆、額顳葉癡呆以及正常壓力腦積水及健康對照組腦脊液中t-tau 蛋白進行定量分析，結果顯示，所有受試者腦脊液中t-tau 水平都顯著增高，因此，t-tau 單獨用于AD 的診斷尚缺乏特異性，不能作為區分其他神經系統疾病的特異性生物標志物。

P-tau 是形成NFTs 的主要物質。研究發現，AD患者體內tau 蛋白至少有25 個異常磷酸化位點［24]，這些位點主要位于與微管結合的181-235 和369-422氨基酸位點。因此，過度磷酸化易導致tau蛋白與微管結合能力下降。目前研究較多的是p-tau 181、p-tau 199 以及p-tau 231，這三者的水平均高于健康對照組，而且分別能很好地鑒別AD 與皮質-脊髓-紋狀體變性、Lewy 癡呆與額顳葉癡呆。其中，p-tau 231 鑒別AD 與其他癡呆類型的靈敏度和特異性高達85%和97%［25]。另有研究發現，對于急性腦血管病等非特異性腦損傷患者，t-tau 含量升高，但p-tau 含量并未升高，這更說明p-tau 具有特異性。對AD 和其他癡呆疾病的診斷，p-tau 具有較高的靈敏度和特異性。

1.3 載脂蛋白

1.3.1 載脂蛋白E(ApoE) ApoE 是一種與膽固醇類物質運輸相關的血漿蛋白，主要在肝臟合成和分泌，其次在大腦。ApoE基因具有多態性和遺傳上的異質性，它在同一基因位點上有3 個等位基因:ε2、ε3和ε4;分別編碼3種蛋白:ApoE2、ApoE3 和ApoE4，其中，ApoE4 最不穩定，具有很高的致病活性。研究發現，ApoE 與家族性AD 和散發性AD 均有很大關聯，ε4能夠提高患AD 的風險;同時在SP和NFTs 中均含有ApoE4，并且與Aβ 的結合能力明顯強于ApoE2 和ApoE3。Ma 等［26]研究發現，ApoE在與Aβ 相互作用的過程中，ApoE4 比ApoE3 更能促進NFTs 的形成，而ApoE2 能夠有效地預防Aβ 的聚集。Fagan 等［27]研究表明，ApoE4 不是導致Aβ沉積的必要因素，但能夠促進可溶性Aβ 形成沉淀。目前，關于ApoE 與Aβ 的作用機制尚不清楚，但值得肯定的是，ApoE 與Aβ 的產生存在著很大關聯。現在普遍認為ApoE4 與Aβ 共沉淀，加速了Aβ 的聚集，提高了患AD 的風險;而ApoE2、ApoE3 可以抑制Aβ 的聚集，起保護作用。

研究發現，ApoE3 能夠與未被磷酸化的tau 蛋白結合，從而防止tau 蛋白的過度磷酸化;然而ApoE4 與tau 蛋白的親和力較差，不能防止tau 蛋白的過度磷酸化［28]，致其形成雙螺旋絲，隨后發展為NFTs，最終引起AD 的發生。Hoe 等［29]研究證明了類似結論:ApoE2 能夠降低tau 蛋白的磷酸化，而ApoE4 則促進tau 蛋白的磷酸化。由于AD 患者ApoE4 升高且具有較高的特異性，隨著研究的深入，ApoE4 將成為一種用于AD 診斷的重要的生物標志物。

1.3.2 載脂蛋白J(ApoJ) ApoJ 又稱簇集蛋白，在血漿中含量較多。血漿ApoJ 水平與AD 存在相關性。研究［30-31]發現，血漿ApoJ 含量高的AD 患者，其嗅皮質、顳上回萎縮速度明顯減慢;也有研究發現，血漿ApoJ 值與內嗅皮質(特別是右側內嗅皮質)Aβ 呈顯著負相關。ApoJ 可能通過某種途徑或機制對AD 的病理生理進程起到保護作用。上述研究均揭示ApoJ 作為一種AD 生物標志物的巨大潛能。

1.4 炎癥性的生物標志物

炎癥反應在AD 的發病中起著重要作用。研究表明，AD 患者外周血中的白細胞介素(interleukin，IL)1、4、6、10、12、16 和18，腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)，轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)與健康對照組比較，差異有統計學意義，尤其是IL-6、10、12、18，TNF-α 和TGF-β 的水平均升高［32]。另有研究發現，伴有嚴重的認知功能損害的AD 患者，其血漿中TNF-α 的水平較低［33]。研究發現，AD 患者TNF-α 受體TNFR1 血清水平明顯高于健康對照組［34]。因此，與炎癥反應相關的細胞因子對AD 的診斷及預防可能具有一定的指導意義。

1.5 生物學上的功能性金屬

金屬離子內部穩態的紊亂與AD 等幾種神經性病變有關。研究發現，在AD 患者大腦內的Aβ 沉淀中，鋅、銅、鐵的含量較高。AD 患者血清中鋅濃度顯著低于健康對照組，而鐵和銅濃度沒有顯著的差異［33]。推測可能是由于鋅與AD 患者大腦中的Aβ和(或)APP 相結合而致其在血清中的水平下降。盡管如此，目前關于AD 患者血清中生物金屬濃度改變的觀點尚未達成一致，仍需要進一步的研究。

1.6 晚期糖基化終末產物(advanced glycation end products，AGEs)

近來研究發現，AD 發病機制與胰島素信號轉導通路異常密切相關，而且糖尿病患者較健康人更易患AD;因此，相關的AD 生物標志物也不斷地被發現。AGEs 是一種具有細胞毒性的物質，隨著病程的發展在糖尿病患者體內不斷堆積，在AD 患者的SP 和NFTs 中均能檢測到。AGEs 與AD 的發病機制相關，參與了AD 的病理形成，最終導致神經元壞死;因此，AGEs 可能成為用于AD 早期臨床診斷的生物標志物。

1.7 阿爾茨海默病相關神經絲蛋白(Alzheimer-associated neuronal thread protein，AD7c-NTP)

AD7c-NTP 是一種跨膜磷蛋白，可能成為AD 早期臨床診斷的生物標志物之一。在AD 患者的腦脊液和尿液中均可檢測到AD7c-NTP，并且其水平的高低與癡呆的嚴重程度呈正相關，而與年齡和性別無關［35]。研究表明，AD 患者腦脊液和尿液中的AD7c-NTP 水平明顯高于健康對照組［36-37]，并且中晚期AD 患者AD7c-NTP 水平要明顯高于早期AD患者［37]。鑒于AD7c-NTP 在早期AD 患者的腦脊液和尿液中均表現為升高，且尿液檢測無創、方便，因此，檢測AD 患者尿液中的AD7c-NTP 水平具有診斷早期AD 的臨床應用價值。

2 其他AD 相關生物標志物

除上述生物標志物外，還有大量關于AD 生物標志物的報道:①異前列腺素(8，12-iso-iPF2α-VI isoprostane，IP)是脂膜氧化損傷產生的物質，在MCI 和AD 患 者 的 腦 脊 液 中 呈 高 表 達［38-39];與Aβ1-42、p-tau 相比，IP 是唯一隨著隨訪時間延長表達水平增高的標志物。②研究發現，MCI 和AD 患者的腦脊液中β-位點淀粉樣蛋白前體蛋白裂解酶1(β-site amyloid precursor protein-cleaving enzyme 1，BACE1)的濃度和活性較健康對照明顯升高。BACE1 是促使APP 裂解成Aβ 最主要的β-分泌酶，其活性與腦脊液中t-tau 蛋白水平呈正相關［40]。③近來研究顯示，miRNA 在神經退行性疾病中起著重要作用，如BACE1 基因的miRNA-29a/b-1 在AD中的表達明顯降低，其缺失使BACE1 蛋白的表達明顯上調，最終導致Aβ 的積累，直至引發AD［41]。隨著進一步研究，miRNA 有可能成為AD 診斷的生物標志物之一。④蛋白質組學和代謝組學的發展，為尋找AD 血液的生物標志物提供了巨大的幫助，相關的異常物質如表皮生長因子、溶血磷脂酰膽堿、色氨酸等相繼被發現。由于各實驗室的實驗方法和技術存在著很大差異，且這些標志物與AD 的病理生理關系還需進一步明確;因此，上述具有潛在應用價值的標志物應用于臨床診斷還需要更深入的研究。

3 總結與展望

關于AD 早期診斷的體液生物標志物的研究已有很多，但迄今尚未發現一種確定的、可靠的生物標志物。腦脊液中Aβ 以及tau 蛋白的研究已取得了較大的成就，對AD 的臨床診斷具有一定的應用價值。但是，腦脊液的采集對患者會造成一定的創傷，而且采集的適應證、禁忌證以及技術性都限制了腰椎穿刺的廣泛應用。由于血液采集創傷較小、簡單易操作，因此，對血液中AD 生物標志物的研究更具有臨床意義。

尋找一種能及早、準確地檢測到AD 的特異性分子病理學改變的生物標志物，還需要更深入的研究。隨著基因組學、蛋白質組學和代謝組學的發展，以及對外周血單個核細胞的深入研究，我們將會發現更多的與AD 相關的基因及其功能蛋白，進而開發出具有高靈敏度和高特異性的生物標志物。

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