滇結香花對α葡萄糖苷酶的抑制活性

耿 燕， 陽紅梅， 許泓瑜， 史勁松

（江南大學 藥學院，江蘇 無錫214122）

滇 結 香 （Edgeworthia gardneri （Wall.） Meissn）主要產于西藏和云南地區[1-2]，其俗名為西藏綠蘿花，據《藏醫養身圖說》，主治糖尿病、冠心病、高血壓、高血脂、血管炎及脈管炎等。 結香花（Edgeworthia chrysantha） 常作為密蒙花（Buddliga officinalis）的偽品進行銷售[3-4]。而綠蘿花為天南星科（Araceae）植物，與結香在外形上差異很多，二者混淆的原因可能在于“夢（夢）花”與“蘿花”的誤讀和誤解[5]。目前，據國內外文獻報道，已從結香中分離出的化合物主要有香豆素類、黃酮類、甾類、有機酸及含氮化合物等，具有抗菌、消炎和鎮痛的作用[1-2]。西藏當地居民將滇結香花通過泡水飲用的方式來治療糖尿病等慢性疾病，但未探明作用機理。有文獻報道，結香中的瑞香黃烷素能抑制腸道上皮的α葡萄糖苷酶活性[6]，抑制小腸α葡萄糖苷酶活性是藥物降血糖機理之一[7-9]，故擬通過研究西藏產滇結香花提取物對α葡萄糖苷酶活性的影響來探尋其活性物質。滇結香花在民間有廣泛的用途，但筆者未見對其安全性評價的資料，作者通過對其活性較好的組分進行體內急毒評價，并在小鼠高血糖模型基礎上研究其降糖活性，為深入開發提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

滇結香（西藏綠蘿花），由西藏月王生物科技有限公司提供；經鑒定為滇結香，為瑞香科、結香屬植物，標本保藏于中國科學院昆明植物研究所植物標本室。阿卡波糖，購自德國拜爾公司；α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase，EC 3.2.1.20）、4-硝基苯 a-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG），購自sigma公司；谷丙轉氨酶試劑盒及谷草轉氨酶試劑盒，購自南京建成科技有限公司；其余試劑為分析純，購自國藥集團化學有限公司。

1.2 實驗動物

6～8周昆明小鼠，購自上海斯萊克動物實驗中心（合格證號:SCXK（滬）2003-0003）；健康雄性 SD（Sprague Dawley）大鼠，體重 200～240 g ，3 月齡，購自上海斯萊克動物實驗中心（合格證號:SCXK（滬）2007-0005）。

1.3 儀器

EL204型電子天平，博特勒托利多公司制造；UV-2100型紫外分光光度計，上海UNICO儀器有限公司制造；GZX-9070MBE數顯鼓風干燥箱，上海博訊實業有限公司醫療設備廠制造；RE-52A旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器有限公司制；恒溫水浴循環鍋，美國POLYSCIENCE制；SpectrAA 220型原子吸收分光光度計，Varian公司制；UV1800型紫外分光光度計，上海美諾達科技有限公司制；Triad冷凍干燥儀，美國 Labeonco公司制；MULTISKAN ASCENT酶標儀，賽默飛世爾儀器有限公司制。

2 方法

2.1 α-葡萄糖苷酶體外抑制實驗

分別選用Sigma公司的酵母源α-葡萄糖苷酶及自提的大鼠α-葡萄糖苷酶，提取方法參考文獻[10]。對α-葡萄糖苷酶抑制作用的具體實驗方法及數據處理見文獻[11]。

2.2 小鼠急性毒性實驗

選取正常昆明小鼠，隨機分為4個劑量組（n=10），雌雄各半，共8組，灌胃給藥:正常對照組；滇結香水提物（EMW）給藥組（1 000、2 500、5 000 mg/kg）。觀察14 d后，通過摘眼球的方式采取動物的血液，靜置 3～4 h，血液分層后，2500 r/min 離心 40 min，取上清液，以備血清生化學指標檢測，然后將各組動物處死，摘取小鼠肝臟等器官，沖洗干凈并稱重。血清中谷草轉氨酶與谷丙轉氨酶的測定按試劑盒說明。動物頸椎脫臼處死，觀察心、肝、腎、肺、脾、腦、胃等器官的體積、顏色、質地及質量等的改變，計算器官指數。器官指數=器官質量/小鼠體質量。

2.3 高血糖模型的建立

90只4周齡雄性昆明小鼠禁食12 h后剪尾取血，用Free-style血糖試紙測定基礎血糖水平，隨機分為正常對照組（10只）和模型組（80只）。模型對照組根據體重左下腹腔注射ALX 150 mg/kg，正常對照組注射生理鹽水，觀察3 d。在給藥第4天后血糖上升到（7.5±1.237）mmol/L，再次注射 50 mg/（kg·d），測定空腹血糖水平，第7天測定其血糖，血糖水平≥11.1 mmol/L確定為高血糖模型。建模成功率為70%。將建好的糖尿病動物模型隨機分為EMW高劑量組（300 mg/kg）、EMW 中劑量組（200 mg/kg）、EMW低劑量組 （100 mg/kg）、阿卡波糖對照組（20 mg/kg）、生理鹽水對照組。實驗期間觀察小鼠皮毛、進食、飲水、尿量、體重等生理情況。給藥后0、0.5、1、2、3、4、5、6 h 采集血樣， 血糖儀測定血糖值。計算給藥后不同時間的血糖質量分數，即

各組分給藥后0 h血糖質量分數為100%。

2.4 數據統計

根據One-Way ANOVA統計學處理實驗結果，結果用平均值±標準差（mean±SD）標示，顯著水平為p＜0.05。

3 結果與分析

3.1 滇結香花活性物質的粗提

稱取150 g滇結香花，按溶劑的極性大小不同，選擇正己烷、石油醚、乙酸乙酯、甲醇、水1 500 mL依次提取2 h，每種溶劑提3次，合并提取液，抽濾掉滇結香花渣滓，濾液旋轉蒸發濃縮至適宜體積。濃縮后有機溶劑粗提物用離心濃縮儀離心濃縮至粉末，水粗提物用凍干機凍干至粉末，備用。滇結香花的正己烷提取率為7.34%、石油醚提取率為14.13%、乙酸乙酯提取率為8.74%、甲醇提取率為11.08%、水提取率為12.24%。

3.2 滇結香花各溶劑粗提取物對α-葡萄糖苷酶抑制作用的初步研究

分別測定滇結香花的 5種提取物和陽性對照阿卡波糖在相同系列質量濃度下（1 000 mg/kg、1 500 mg/kg、2 000 mg/kg）其對酵母源與大鼠源α葡萄糖苷酶的抑制活性。表1顯示各粗提物在不同篩選濃度下，抑制效果變化不大，除正己烷提取物外，質量濃度1 000 mg/kg時，其它 5種提取物對酵母來源α葡萄糖苷酶的抑制活性均高于陽性對照藥阿卡波糖（（30.67±1.32）%），且存在顯著差異（p＜0.05或p＜0.01）。 而對大鼠源α葡萄糖苷酶，僅有水提物的抑制活性（（34.20±1.36）%）高于阿卡波糖（（28.80±1.78）%），且存在顯著差異（p＜0.05）。 表明僅有EMW質量濃度1 000 mg/kg時具有較好的酵母源和大鼠源α葡萄糖苷酶抑制活性。有文獻報道，酵母來源α葡萄糖苷酶體外抑制實驗存在一定的假陽性情況[8-9]，應優先考慮采用動物來源的α葡萄糖苷酶，綜合考慮，滇結香花水提取物體外抑制活性最好。

表1 滇結香花提取物對酵母和大鼠來源α-葡萄糖苷酶的體外抑制活性Table 1 Yeast and rat intestinal α-glucosidase inhibitory activity of different extracts from E.gardneri in vitro

3.3 滇結香花水粗提取物急性毒性作用初步研究

選擇有較明顯抑制α-葡萄糖苷酶活性的水提物進行急性毒性初探。經預試，無法做出LD50，滇結香花水提取物致死量大于5 000 mg/kg，毒性較低。不同滇結香水提物給藥組（1000、2500、5 000 mg/kg）一次給藥觀察14 d期間小鼠的死亡率為0。小鼠飲食、飲水、體重、皮毛與正常組比較，沒有統計學差異。其谷丙轉氨酶（GPT）和谷草轉氨酶（GOT）的活性與正常組比較（圖1），沒有顯著差別。心、肝、腎、肺、脾、腦、胃等器官指數顯示（表2-3），滇結香花水提物無明顯的器官毒副作用。

圖1 滇結香花水提物一次灌胃14 d后對小鼠GOT和GPT的影響Fig.1 Effect of oral administration of EMW once on the activity of GOT and GPT in mice after 14 days

表2 雄性小鼠一次灌胃滇結香花水提物14 d后其器官指數（mean±SD，n=10）Tab.2 Organ index of oral administration of EMW once in male mice after 14 days （mean±SD，n=10）

3.4 滇結香花水提物對高血糖模型組小鼠的影響

滇結香花水提物在體外有較高的α-葡萄糖苷酶活性抑制作用且無明顯毒副作用，進一步在動物整體水平考察其降血糖的活性。如圖2所示，阿卡波糖給藥0.5 h后即可下調高血糖模型小鼠血糖水平，給藥1～3 h血糖下降幅度最大，與對照組相比存在顯著差異 （p＜0.05），給藥4 h后血糖回升至0 h濃度。EMW高中低劑量給藥在1 h后都可下調小鼠血糖水平，但低劑量（100 mg/kg）給藥3 h后血糖回升至原來濃度。EMW中劑量給藥（200 mg/kg）3 h后小鼠血糖下降幅度最大，2～4 h小鼠血糖質量比數對照組相比存在顯著差異（p＜0.05），5 h后血糖回升至0 h濃度。EMW高劑量給藥（300 mg/kg）4 h后血糖下降幅度最大，2～5 h與對照組相比存在顯著差異（p＜0.05），給藥6 h后血糖回升至0 h濃度。滇結香花水提物對高血糖模型小鼠的降血糖幅度大小、藥效持續時間與給藥濃度成正比，與陽性藥物相比對血糖控制作用更持久并且效果溫和。

表3 雌性小鼠一次灌胃滇結香花水提物14 d后其器官指數（mean±SD，n=10）Tab.3 Organ index of oral administration of EMW once in female mice after 14 days（mean±SD，n=10）

圖2 滇結香花水提物對高血糖模型小鼠血糖的影響Fig.2 Effect of EMW on the blood concentration in hyperglycemia mice

4 結語

目前醫學界已將α-葡萄糖苷酶抑制劑列為第3類口服降糖藥[12]。此類藥物對一、二型糖尿病均適用。代表藥物如阿卡波糖，其作用機制為抑制位于小腸絨毛上皮細胞刷狀緣的α-糖苷酶的活性從而抑制二糖和低聚糖降解為單糖如葡萄糖，進而延緩葡萄糖的吸收，并轉化葡萄糖依賴的腸激素的釋放，但其有腹部不適、腹瀉、胃腸脹氣等不良反應。中藥等天然藥物降血糖療效明確，副作用小[13]，作者采用α葡萄糖苷酶體外抑制模型對產于西藏地區的滇結香花進行降糖活性組分篩選，結果表明，滇結香花水提取物體外抑制活性最好。小鼠急性毒性實驗表明滇結香花水提取物無明顯毒副作用，且水提物對小鼠高血糖模型有一定的降糖作用，故可對該提取物進行進一步分離純化，追蹤其活性成分，并在動物整體水平評價其降糖作用，進而研究其調節血糖的機制，這些研究將有助于開發治療糖尿病的新藥。

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