樺褐孔菌多糖IOP3a體內抗腫瘤活性及其機制

陳義勇， 黃友如， 劉晶晶， 鄭麗雪， 徐 兵

（常熟理工學院 生物與食品工程學院，江蘇 常熟 215500）

樺褐孔菌（Inonotus obliquus）是一種生長在寒帶的藥用真菌，寄生于白樺樹、銀樺等樹干或樹皮下，主要生長區域為北美、波蘭、俄羅斯、中國的黑龍江和吉林、日本北海道等國家和地區[1]。國內陳義勇等[2-3]研究表明，樺褐孔菌多糖對Jurkat荷瘤具有抗腫瘤活性；金光等[4]研究表明，樺褐孔菌多糖對小鼠S180肉瘤具有較強的抑制作用；張慧麗等[5]研究發現，樺褐孔菌多糖對肝癌SMMC7721細胞株增殖具有抑制作用，且表現出濃度相關性。國外Kim等[6-7]認為，樺褐孔菌多糖對BDF1鼠黑色素瘤生長有明顯抑制作用，樺褐孔菌菌核多糖直接通過抑制腫瘤細胞生長和蛋白質合成而產生抗癌作用。通過查閱文獻發現，樺褐孔菌多糖的抗腫瘤活性主要停留在粗多糖研究層面，而樺褐孔菌多糖單一組分的抗腫瘤活性及其作用機制還未見報道。

筆者前期分離得到一個樺褐孔菌多糖單一組分IOP3a，經過活性篩選，發現IOP3a具有較強的體外抗腫瘤活性，但是體內抗腫瘤活性及其作用機制還需進一步研究。所以作者以IOP3a為研究對象，通過建立移植型裸鼠淋巴瘤細胞Jurkat模型，通過研究荷瘤裸鼠的指標（如移植瘤體積變化、抑瘤率、脾指數、外周血白細胞和淋巴細胞、巨噬細胞產生細胞因子TNF-α和L-1β）以及裸鼠瘤塊組織病理學觀察，探討IOP3a的體內抗腫瘤活性，通過蛋白質印跡技術檢測IOP3a處理后不同組荷瘤裸鼠的腫瘤組織中抑癌基因Bcl-2蛋白和促癌基因Bax蛋白的表達情況，分析樺褐孔菌多糖IOP3a可能的體內抗腫瘤作用機制，旨在為其治療腫瘤及其開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樺褐孔菌多糖IOP3a樣品 本實驗室前期分離純化自制，經HPLC測定IOP3a相對分子質量為44265 Da，單糖由鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖組成，其摩爾比為 2.5∶4.6∶1∶2.6。

1.1.2 Jurkat細胞 人T淋巴細胞白血病細胞株，購自中國人民解放軍軍事醫學科學院。

1.1.3 Balb/c-nu/nu裸鼠 購自中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心，許可證號：SCXK-（軍）2002-001。

1.2 主要試劑

5-氟尿嘧啶（5-Fu），上海利鉑化學技術有限公司提供；RPMI1640培養液，北京萬域美瀾科技有限公司提供；白細胞介素-1β（L-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）檢測試劑盒，上海酶聯生物科技有限公司提供；鼠抗人Bcl-2，上海億欣生物科技有限公司提供；Bax單克隆免疫組化試劑盒，上海谷研科技有限公司提供；辣根酶標記的山羊抗兔IgG，杰蘭爾試劑上海分公司提供；羊抗人β-肌動蛋白多克隆抗體，上海今邁生物科技有限公司提供；二氨基聯苯胺（DAB）顯色試劑盒，天津百浩生物科技有限公司提供；其它試劑均為國產分析純。

1.3 主要儀器

RM2135石蠟切片機，德國Leica公司產品；DYCZ-25D型電泳儀，北京市六一儀器廠產品；36XB光學顯微鏡，上海光學儀器廠產品；LH750全自動血細胞分析儀，美國Beckman Coulter公司產品；GelDoc-IT TS2凝膠成像系統，美國UVP公司產品。

1.4 實驗方法

1.4.1 Jurkat裸鼠荷瘤模型的建立 Balb/c-nu/nu裸鼠，雄性，3～5 周齡，體質量（20±2）g，放置在空氣凈化室飼養，室度（25±2）℃，實驗過程達到無特定病原體（Specific Pathogen Free，SPF）條件，自由攝入無菌水和滅菌標準飼料一周后，裸鼠經Co60照射（劑量250 Gcy）3 d后，在每只裸鼠背部皮下接種0.2 mL Jurkat細胞（1×107cells/mL），每只裸鼠兩個注射點，每天觀察裸鼠腫瘤形成情況，裸鼠皮下5 d后出現結節隆起約5 mm，成瘤率達到100%。成功建立的Jurkat裸鼠荷瘤模型見圖1。

圖1 Jurkat裸鼠荷瘤模型Fig.1 Cancer nude mice transplanted jurkat tumor

1.4.2 動物分組及給藥 造模后的Balb/c-nu/nu裸鼠隨機分為5組，包括空白對照組、5-Fu陽性對照

組（20 mg/（kg·d）、IOP3a 大劑量組（30 mg/（kg·d）、中劑量組（20 mg/（kg·d）和小劑量組（10 mg/（kg·d），每組5只。空白對照組每只裸鼠注射0.2 mL生理鹽水，5-Fu陽性對照組每只裸鼠注射0.2 mL 5-Fu，調節藥物濃度使藥量達到20 mg/kg，采用灌胃法給藥，每天一次，連續28 d。

1.4.3 荷瘤裸鼠移植瘤體積變化 每組裸鼠從給樣品后開始，用游標卡尺分別在第7、14、28天作一次活體腫瘤大小（包括最大長徑a和橫徑b）測量，根據公式

計算腫瘤體積（V），以每組裸鼠瘤體積平均值為縱坐標，處理時間為橫坐標，繪制移植瘤生長曲線。參見文獻[8]。

1.4.4 IOP3a對荷瘤裸鼠的抑瘤作用 實驗第29天后處死裸鼠后稱重，摘取瘤塊，用生理鹽水洗滌，然后用濾紙吸干稱重，根據公式

1.4.5 IOP3a對荷瘤裸鼠脾臟的影響 實驗第29天后處死裸鼠，摘取脾臟，用生理鹽水洗滌，然后用濾紙吸干稱重，根據公式

計算脾臟指數。

1.4.6 IOP3a對荷瘤裸鼠外周血白細胞和淋巴細胞的影響 實驗第29天后通過裸鼠眼眶取血，經全自動血細胞分析儀計算白細胞和淋巴細胞數。

1.4.7 IOP3a對裸鼠巨噬細胞產生細胞因子的影響詳見文獻[9]。

1）小鼠腹腔巨噬細胞的制備：裸鼠頸椎脫臼處死，酒精消毒，腹腔注射5 mL RPMI1640培養液，輕揉腹腔3 min，收集腹腔液，2 000 r/min離心5 min，棄上清液，用RPMI1640培養液調整細胞濃度至2×109/L。將巨噬細胞懸液接種于96孔細胞培養板中，每孔100 μL，37℃條件下在5%CO2培養箱中孵育3 h，吸棄培養液，用RPMI1640培養液洗去未貼壁的細胞，即得純化的裸鼠腹腔巨噬細胞。

2）L-1β和TNF-α含量的測定：將96孔培養板中的裸鼠腹腔巨噬細胞分為陰性對照組、陽性對照組和不同劑量的IOP3a多糖給藥組，吸棄上清液，陰性對照組加入150 μL的RPMI1640培養液，陽性對照組加入150 μL含5-Fu的 RPMI1640培養液（質量濃度10 mg/L），給藥組每孔分別加入150 μL含IOP3a多糖的RPMI1640培養液 （質量濃度分別為 50、100、200 mg/L）， 每組設 6個復孔，37 ℃培養48 h后，吸取上清液，用雙抗夾心ELISA法測定培養上清液中L-1β和TNF-α的水平，操作步驟按檢測試劑盒中的說明書進行。

1.4.8 瘤塊組織切片病理學觀察 取裸鼠Jurkat瘤塊組織，用體積分數10%甲醛固定24 h，通過常規脫水、石蠟包埋、切片（厚度4 μm）、蘇木精-伊紅染色，對裸鼠Jurkat瘤塊組織進行病理學觀察。

1.4.9 蛋白質印跡法檢測Jurkat腫瘤組織中Bcl-2和Bax蛋白表達 稱取腫瘤組織0.3 g，4℃條件下用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌4次，將組織剪碎后加入5 mL預冷組織裂解液，冰上裂解60 min，裂解產物在4℃條件下5 000 r/min離心20 min）后得到細胞蛋白上清液，采用Bradford法測定蛋白質濃度，根據蛋白質含量測定結果每孔加入20 μg蛋白質，在待測細胞蛋白上清液中加入等體積的加樣緩沖液，然后混合，在沸水浴中加熱5 min，進行SDSPAGE凝膠電泳分離，電泳結束后用去離子水漂洗凝膠，冰浴條件下將蛋白電轉移至硝酸纖維素膜上，用PBST（質量分數0.02%Tween-PBS）配制的質量分數5%脫脂奶粉溶液在37℃條件下膜封閉2 h，然后分別加入一抗（1∶200稀釋）鼠抗人 Bax、Bcl-2和β-Actin（β-肌動蛋白），確定上樣量的一致性，室溫下反應2 h后用PBST清洗3次，每次15 min，再與辣根酶標記的山羊抗兔IgG二抗（1∶800稀釋）室溫下反應1 h，用PBST充分洗滌后，DAB室溫下顯色，利用凝膠成像系統分析免疫組化圖片。

1.4.10 數據統計分析 采用SAS軟件AVOVA程序進行顯著性分析，Duncan程序進行多重比較。

2 結果與討論

2.1 荷瘤裸鼠移植瘤生長曲線

荷瘤裸鼠移植瘤生長曲線如圖2所示。可知，與對照組比較，IOP3a大劑量組瘤體積增長最慢，而對照組裸鼠移植瘤體積持續增長，說明IOP3a具有較好的抑制荷瘤裸鼠腫瘤生長的作用。

2.2 IOP3a對裸鼠Jurkat肉瘤的抑制作用

裸鼠連續給藥28 d后，各組荷瘤裸鼠的瘤質量、抑瘤率等見表1。統計學分析表明：與陰性對照組的瘤質量相比，IOP3a高、中劑量組瘤質量均有顯著性差異 （p＜0.05）， 抑瘤率分別為 69.28%和57.62%，隨著多糖劑量的增加，裸鼠移植性腫瘤質量下降顯著，并存在明顯的劑量—效應關系，5-Fu陽性對照組瘤質量與陰性對照組的瘤質量相比差異顯著（p＜0.05），發現裸鼠的進食量、行為狀態等狀況明顯差于IOP3a組，這主要是因為5-Fu會對裸鼠的免疫器官造成一定的損害，而樺褐孔菌多糖IOP3a對裸鼠的免疫沒有損害。

圖2 荷瘤裸鼠移植瘤生長曲線Fig.2 Growth curve of nude mice transplanted jurkat tumor

表1 IOP3a對裸鼠Jurkat肉瘤的抑制作用（，n=5）Table 1 Anti-tumor activities of IOP3a against tumorbearing nude mice（，n=5）

表1 IOP3a對裸鼠Jurkat肉瘤的抑制作用（，n=5）Table 1 Anti-tumor activities of IOP3a against tumorbearing nude mice（，n=5）

注：與陰性對照組比較，a： p＜0.05。

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2.3 IOP3a對荷瘤裸鼠免疫器官的影響

樺褐孔菌多糖IOP3a對荷瘤裸鼠免疫器官脾臟的影響見表2，可知：與陰性對照組相比，5-Fu陽性組脾臟指數明顯降低（p＜0.05），表現出一定的毒副作用，IOP3a治療組的脾臟指數與陰性對照組均無顯著性差異，無明顯毒副作用，并且明顯高于5-Fu組（p＜0.01），隨著劑量的增加，脾臟指數有逐步增加的趨勢。

表2 IOP3a對荷瘤裸鼠脾臟指數的影響Table 2 Effect of IOP3a on spleen index of tumorbearing nude mice（，n=5）

表2 IOP3a對荷瘤裸鼠脾臟指數的影響Table 2 Effect of IOP3a on spleen index of tumorbearing nude mice（，n=5）

注：與陰性對照組比較，a：p＜0.05；與陽性對照組比較b： p＜0.01。

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2.4 IOP3a對荷瘤裸鼠外周血白細胞和淋巴細胞的影響

樺褐孔菌多糖IOP3a對荷瘤裸鼠外周血白細胞和淋巴細胞的影響見表3，可知：與陰性對照組相比，5-Fu組白細胞和淋巴細胞數均明顯降低 （p＜0.05）；與5-Fu陽性對照組相比，IOP3a作用的荷瘤裸鼠的白細胞和淋巴細胞數高于陽性對照組 （p＜0.01），說明IOP3a具有一定的升高裸鼠白細胞和淋巴細胞的功能。

表3 IOP3a對荷瘤裸鼠外周血白細胞和淋巴細胞的影響（，n=5）Table3 EffectofIOP3a on whiteblood celland Lymphocyte of nude mice（，n=5）

表3 IOP3a對荷瘤裸鼠外周血白細胞和淋巴細胞的影響（，n=5）Table3 EffectofIOP3a on whiteblood celland Lymphocyte of nude mice（，n=5）

注：與陰性對照組比較，a：p＜0.05；與陽性對照組比較b： p＜0.01。

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2.5 IOP3a對裸鼠巨噬細胞產生細胞因子的影響

IOP3a對裸鼠巨噬細胞產生細胞因子L-1β和TNF-α的影響見表4。可以看出，與陰性對照組相比，IOP3a多糖對巨噬細胞產生的細胞因子TNF-α和 L-1β 均有明顯的促進作用 （P＜0.01，P＜0.05），且IOP3a多糖對TNF-α的促進作用具有劑量依賴關系，在IOP3a多糖質量濃度為200 mg/L時最為顯著，培養上清液中TNF-α的質量濃度達 （279.35±36.24）ng/L，而IOP3a多糖對L-1β的促進作用無劑量依賴關系，在IOP3a多糖質量濃度為100 mg/L時最為顯著，培養上清液中L-1β的質量濃度達（49.32±12.09）ng/L，與陽性對照5-Fu相比無明顯差異。

表4 IOP3a對裸鼠巨噬細胞產生細胞因子的影響Table 4 Effect of IOP3a on generation of cytokines from macrophage of nude mouse

2.6 組織病理學觀察

裸鼠連續給藥28 d后，裸鼠Jurkat肉瘤病理組織學觀察見圖3。可以看出：陰性對照組腫瘤結構無明顯改變，生長旺盛，IOP3a組、5-Fu組腫瘤體積明顯小于陰性對照組，瘤塊組織松脆，IOP3a組瘤組織出現壞死，有明顯的腫瘤壞死灶，5-Fu陽性組瘤組織大面積壞死，結構不清。

圖3 裸鼠Jurkat肉瘤病理組織學（400×）Fig.3 Histopathology of tumors from transplanted tumor nude mice（400×）

2.7 IOP3a對裸鼠Jurkat腫瘤組織中Bax和Bcl-2基因蛋白表達的影響

Bcl-2家族蛋白根據其功能分為兩類：一類以Bax、Bad、Bak、Bid 為代表，促進細胞凋亡；另一類以Bcl-2、Bcl-xl為代表，抑制細胞凋亡，Bcl-2家族蛋白通過二聚體網絡形式相互作用，調控細胞的凋亡[10-11]。IOP3a對裸鼠 Jurkat腫瘤組織中 Bax和Bcl-2基因蛋白表達的影響結果見圖4和表5。

由圖4可知：β-Actin（β-肌動蛋白）基因表達量不隨藥物處理變化，呈現穩定的表達，隨著IOP3a處理濃度的增大，Jurkat腫瘤組織細胞中Bax基因表達條帶變寬、變深，光密度值與陰性對照組相比不斷增大，差異顯著（p＜0.05），見表 5，明顯抑制Bcl-2基因的表達（p＜0.05）。5-FU組顯著地促進腫瘤組織細胞中Bax基因蛋白的表達，同樣明顯抑制Bcl-2基因的表達（p＜0.05）。表明 IOP3a通過促進腫瘤組織細胞中Bax蛋白表達、抑制Bcl-2表達起到抗腫瘤作用。

圖4 IOP3a對裸鼠Jurkat腫瘤組織中Bax和Bcl-2基因蛋白表達的影響Fig.4 Effect of IOP3a on expression of Bax and Bcl-2 in Jurkat tumors from the transplanted tumor nude mice through immunohistochemical analysis

表5 不同組Bax、Bcl-2基因蛋白表達定性分析Table 5 Quantitative analysis of the expression of Bax and Bcl-2 proteins

3 結語

通過對IOP3a體內抗腫瘤作用及其機制進行研究，得出如下結論：

1）通過建立裸鼠Jurkat模型評價IOP3a的體內抗腫瘤效果，IOP3a可以明顯地抑制荷瘤裸鼠腫瘤體積，具有很好的抑制腫瘤生長的作用。IOP3a高、中劑量組瘤質量與陰性對照組的瘤質量相比均有顯著性差異（p＜0.05），腫瘤抑制率分別為69.28%和57.62%，有明顯的劑量—效應關系，隨著劑量的增加，脾臟指數有逐步增加的趨勢，具有升高裸鼠白細胞和淋巴細胞的功能，IOP3a多糖對巨噬細胞產生的細胞因子TNF-α和L-1β均有明顯的促進作用，組織病理學觀察表明，IOP3a可使腫瘤組織中呈現明顯腫瘤壞死灶、瘤組織出現壞死的現象。

2）免疫組化表明，IOP3a通過促進腫瘤組織細胞中Bax蛋白表達、抑制Bcl-2表達起到抗腫瘤的作用。

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