不同溫度下嗅覺可視化技術區分豬肉中主要致腐菌

鄒小波， 郭雅寧， 石吉勇， 黃曉瑋， 黃 林， 李 昕

（江蘇大學 食品科學與生物工程學院，江蘇 鎮江 212000）

目前豬肉中致腐菌的檢測方法有GC/MS[1-2]、微生物培養[1]等方法。這些方法可以準確地區分豬肉中的不同致腐菌，但是過程復雜、試驗周期長、成本高，不能做到快速檢測及時判斷。目前大部分研究僅針對4℃冷藏貯藏條件下的豬肉致腐菌檢測[3-6]。在我國很多地方，豬肉從屠宰到餐桌往往要經歷冷凍、冷藏等多種貯藏方式，甚至在冷鏈不完善的地區還要在常溫下貯藏，因此有必要針對室溫（20℃），冷藏（4℃）和冷凍（-16℃）3種貯藏溫度條件下，對豬肉中主要致腐菌的快速、無損檢測技術進行研究。

嗅覺可視化技術是一種氣體成像技術[7-9]，該技術根據可視化傳感器與待測氣體反應前后的顏色變化對氣體進行定性定量判別[10-12]。可視化傳感器不僅利用氣體敏感材料和待測氣體之間的范德華力等很弱的相互作用，而且引入了金屬鍵和極性鍵等較強的化學反應，所以在檢測精度和靈敏度方面具有很強的優勢[13-15]。

豬肉貯藏過程中主要致腐菌對豬肉腐敗起主導作用，其利用豬肉中的蛋白質、碳水化合物、脂肪等營養物質進行自身代謝，產生的代謝產物如硫化物、胺類等可導致豬肉的氣味和pH值發生變化，同時這些氣體的種類和濃度與微生物種群及其數量也有密切的關系。作者精心挑選4種卟啉化合物組成可視化傳感器，分別在室溫（20℃）、冷藏（4℃）和冷凍（-16℃）3種貯藏條件下，通過嗅覺可視化傳感器與揮發性氣體反應前后的顏色變化，嘗試對豬肉中的3種主要致腐菌進行區分。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與菌種 豬肉購于江蘇省鎮江市屠宰場，為生鮮背最長肌。按照文獻[1]所述方法取其內部無污染肉塊約1 080 g，修去筋腱。

豬肉貯藏過程中的主要致腐菌為韓國假單胞桿菌、熱殺索絲菌及梭狀芽胞桿菌，它們均為實驗室分離純化、鑒定后保存的菌種[1，16-20]。

1.1.2 試劑 無菌生理鹽水，體積分數75%酒精，卟啉試劑（Sigma，美國）。

1.1.3 儀器與設備 壓力蒸汽滅菌鍋（YM50型，上海，三申醫療器械）；雙人單面凈化工作臺（SW-CJ-2FD 型，蘇州）；冰箱（美的，合肥）；生物顯微鏡（XS-212-202 型，南京，JNOEC）；生化培養箱（LRH-150型，上海，一恒科技）；掃描儀（Scanjet G4050型，美國，HP）。

1.2 樣本制備

1.2.1 肉塊的制備 于無菌操作臺將豬肉分割成108塊，精確稱取10 g左右的均勻小塊，進行表面滅菌后裝入無菌薄膜袋中備用。

1.2.2 接種與貯藏 參照文獻[1]的方法，韓國假單孢菌、熱殺索絲菌和梭狀芽孢桿菌經過培養，獲得菌原液。取上述分割好的無菌肉塊12塊作為對照組，再取36塊分為3組，每組12塊，分別浸泡于3種菌原液中，15 s后取出，瀝干菌液，裝入無菌薄膜袋中[14]。將接種后的豬肉按類分別放在20、4℃和-16 ℃條件下貯存，20 ℃條件下分別于 0、8、16、24 h后取樣分析，4℃條件下分別于 0、2、4、6 d后取樣分析，-16℃條件下分別于0、3、6、9 d后取樣分析。

1.2.3 腐敗菌計數 參照文獻[21]的方法，在無菌操作條件下，將樣品剪碎放入含有10 mL滅菌生理鹽水的滅菌乳缽內，經充分研磨做成均勻稀釋液。用無菌微量移液器吸取0.1 mL樣品勻液，沿管壁緩慢注入盛有10 mL稀釋液的無菌試管中（注意吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管，制成體積比1∶100的樣品勻液。選擇2個適宜稀釋度的樣品勻液，在顯微鏡下進行計數。

1.3 嗅覺可視化技術檢測方法

1.3.1 傳感器的制作 針對豬肉腐敗過程中氣味變化的特點，從200多種卟啉中優選出4種與豬肉揮發氣體發生反應最靈敏的卟啉化合物組成可視化傳感器陣列。為減少環境濕度對傳感器精度的影響，選擇具有良好疏水性的C2反相硅膠板作為傳感器載體，其微小的孔徑可以幫助吸附氣體分子加快檢測速度。利用毛細管點樣法將氣敏材料固定在傳感器載體，形成一個如圖1所示的2×2的可視化傳感器陣列。

圖1 傳感器陣列Fig.1 Sensor array

1.3.2 跟蹤檢測 取已準備好的60塊豬肉，將其放在特制的容器底部，將傳感器陣列放置在容器頂部，然后將裝置密封放于恒溫避光處。可視化傳感器陣列上色敏材料（卟啉）的顏色變化用掃描儀掃描獲取[15-16]。針對不同溫度下的樣品，跟蹤監測的間隔不一樣，20℃下每隔8 h掃描一次，4℃下每隔2 d掃描一次，-16℃下每隔3 d掃描一次。

1.4 傳感器響應信號提取和數據建模分析

可視化傳感器與豬肉頂空可揮發性氣體發生顏色反應，只有對傳感器與豬肉氣體發生反應前后的圖像進行圖像處理，使其數字化，才能對這些變化進行定量描述，進而用來檢測樣品。由掃描儀獲得的傳感器反應前后圖像經過圖像處理，通過如下公式提取可視化傳感器陣列上色敏材料 （卟啉）反應前后顏色變化的絕對值ΔR、ΔG、ΔB。

式中，a（after）代表可視化傳感器陣列與待檢測氣體反應后的圖像，b（before）代表可視化傳感器陣列與待檢測氣體反應前的圖像。將ΔR、ΔG、ΔB值作為輸入變量，應用Matlab7.0軟件建立模型進行PCA分析[22]。

2 結果與分析

2.1 致腐菌變化規律

圖2（a）（b）（c）分別為-16、4 和 20 ℃條件下豬肉中3種主要致腐菌（韓國假單胞桿菌、熱殺索絲菌、梭狀芽胞桿菌）的菌總數變化圖。從圖2中可以看出在這3種溫度下豬肉的致腐菌總數的初始值均為103-104個/g。隨豬肉存放時間的增加，3種腐敗菌的總數均呈明顯的上升趨勢。

圖2 -16，4，20℃下豬肉中菌數變化情況Fig.2 Bacteria count changes in pork at-16，4，20 ℃

如圖2（a）所示，在-16℃條件下，致腐菌菌總數在第9天時達到107個/g。菌總數與初始值相比增加了一倍，韓國假單胞桿菌明顯是優勢菌。如圖2（b）所示，在4℃條件下，由于溫度升高，細菌生長速率相對加大，在第6天的時候就已經達到107個/g，此時也達到了初始菌數的兩倍。如圖2（c）所示，在20℃條件下，細菌生長速率明顯加大，在16 h后就已達到107個/g，在24 h后達到108個/g并伴隨著明顯的腐臭味，在這3種溫度條件下，豬肉中3種主要致腐菌的生長速率的增加程度都比較明顯，且韓國假單胞桿菌是造成豬肉腐敗的主要菌群，在-16℃條件下尤其明顯，結果與文獻[1]一致。

2.2 嗅覺可視化技術檢測

表1為20、4℃和-16℃ 3種貯藏溫度下，嗅覺可視化傳感器跟蹤檢測染有3種致腐菌豬肉樣本的特征圖像。由特征圖像可以看出，每幅圖的反應變化都有所不同，隨著豬肉貯藏時間的延長，傳感器的響應范圍在擴大，且反應強度也逐漸增強。從嗅覺可視化傳感器陣列顏色變化（圖3）中，能夠看出染有3種致腐菌（韓國假單胞桿菌、熱殺索絲菌、梭狀芽胞桿菌）的豬肉樣本有明顯的差異，并且在不同溫度下（不同貯藏時間）（20 ℃（8、16、24 h），4 ℃（2、4、6 d），-16 ℃（3、6、9 d））豬肉的變質情況不同。這是由于不同的菌產生的揮發性氣體的質量分數有一定的差異，并且隨著貯藏時間的延長，豬肉頂空揮發性氣體成分的種類和濃度不斷變化所致。

前期相關研究[15，21]表明，生鮮豬肉處于貯藏初期，新鮮度高，揮發性氣體成分較少，多是烴類和酮類等氣體，只能通過與少許金屬卟啉發生非特異性吸附，反應強度較弱。隨著貯藏時間的延長，生鮮豬肉品質開始下降，與腐敗有關的含硫含氮氣體分子開始產生。此時，金屬卟啉容易與含硫和含氮氣體分子發生特異性吸附，金屬卟啉中的金屬離子與這些化合物中的硫原子和氮原子發生鍵合得到電子對形成配位鍵，從而引起較強烈反應，傳感器反應強度愈來愈明顯。對照組豬肉樣本由于其自身內部含有少量細菌導致其腐敗變質，并且每種致腐菌在不同溫度下生長速度不一樣，產生的氣味也有差別。染有韓國假單胞菌豬肉樣本產生的揮發性氣體中含硫化合物、酯和酸比較多；染有熱殺索絲菌豬肉樣本產生的揮發性氣體中揮發性酸較多；染有梭狀芽胞桿菌豬肉樣本的揮發性氣體中分子胺和氨類物質較多。這也就是可視化氣體傳感器可以區分不同菌種不同貯藏時間的主要原因。

圖3 豬肉在20℃、4℃和-16℃下0～24 h、0～6 d和0～9 d的特征圖像Fig.3 Feature images of pork storing below 20 ℃，4 ℃ and-16 ℃ during 0～24 h，0～6 d and 0～9 d

2.3 數據處理與分析

在-16、4℃和20℃這3種貯藏溫度下，傳感器陣列圖像上每個卟啉化合物的ΔR、ΔG、ΔB值組成3個15×4×3的矩陣，將這些矩陣分別進行主成分分析。在20℃常溫條件下的第一主成分的貢獻率為59.82%，第二主成分的貢獻率為21.34%；在4℃冷藏條件下的第一主成分的貢獻率為64.48%，第二主成分的貢獻率為22.32%；在-16℃冷凍條件下的第一主成分的貢獻率為67.23%，第二主成分的貢獻率為24.41%。樣本經PCA分析后的數據前兩個主成分的二維投影如圖 4 所示，圖 4（a）（b）（c）分別為3種貯藏溫度條件下，傳感器區分對照組、染有梭狀芽孢桿菌樣本、染有熱死環絲菌樣本、染有假單胞菌樣本的情況。

從圖3中可以明顯看出，3種染菌組均能相互分開。

圖4 主成分分析結果Fig.4 Principal component scatter plot

圖3（a）為20℃條件下的主成分分析結果，染有韓國假單胞桿菌的14個樣本均能被正確識別，1個樣本被誤判為染有熱死環絲菌樣本組；染有熱殺索絲菌和梭狀芽胞桿菌的豬肉樣本組均能被正確識別，總體識別率達到98%。

3 結語

在-16、4、20℃這3種貯藏溫度下，嗅覺可視化技術結合主成分分析方法對豬肉中的3種主要致腐菌進行了檢測，結果顯示韓國假單胞桿菌樣本組的識別率為98%，梭狀芽孢桿菌和熱殺索絲菌樣本組的識別率均為100%。表明，應用嗅覺可視化技術可以區分豬肉中的上述3種主要致腐菌。

[1]彭勇.冷卻豬肉常見腐敗微生物致腐能力的研究[D].北京：中國農業大學，2005：1-16.

[2]馬瑜璐，朱斌，張雷，等.頂空固相微萃取-氣質聯用檢測豬肉新鮮度[J].食品科學，2011，32（14）：253-256.MA Yu-lu，ZHU Bin，ZHANG Lei，et al.Evaluation of pork freshness by HS-SPME-GC-MS[J].Food Scenice，2011，32（14）：253-256.（in Chinese）

[3]李苗云，趙改名，張建威，等.冷卻豬肉貯藏過程中主要腐敗菌的聚類分析[J].中國農業科學，2011，44（12）：2531-2536.LI Miao-yun，ZHAO Gai-ming，ZHANG Jian-wei，et al.Cluster analysis of the main spoilage bacteria during storage in chilled pork[J].Scientia Agricultura Sinica，2011，44（12）：2531-2536.（in Chinese）

[4]李苗云，張秋會，高曉平，等.冷卻豬肉貯藏過程中腐敗品質指標的關系研究[J].食品與發酵工業，2008（7）：186-189.LI Miao-yun，ZHANG Qiu-hui，GAO Xiao-ping，et al.Study on the relationship of spoilage quality indexes of chilled pork during storage[J].Food and Fermentation Industries，2008（7）：186-189.（in Chinese）

[5]肖虹，謝晶.不同貯藏溫度下冷卻肉品質變化的實驗研究[J].制冷學報，2009（3）：40.XIAO Hong，XIE Jing.Experiment on chilled pork under different storage temperature[J].Journal of Refrigeration，2009（3）：40.（in Chinese）

[6]甄少波.CO在冷卻豬肉氣調包裝中的應用及安全性評價[D].北京：中國農業大學，2006.

[7]鄒小波，張建，趙杰文.嗅覺可視化技術及其對四種食醋的識別[J].農業工程學報，2008（6）：173-176.ZOU Xiao-bo，ZHANG Jian，ZHAO Jie-wen.Identification of four vinegars by olfaction visualization technology[J].Transactions of the CSAE，2008（6）：173-176.（in Chinese）

[8]鄒小波，趙杰文，殷曉平，等.嗅覺可視化技術在白酒識別中的應用[J].農業機械學報，2009（1）：116-119.ZOU Xiao-bo，ZHAO Jie-wen，YIN Xiao-ping，et al.Chinese liquors identification by olfaction visualization technology[J].Transactions of the Chinese Society for Agricultural Machinery，2009（1）：116-119.（in Chinese）

[9]趙杰文，張建，鄒小波.嗅覺可視化技術及其對5種化學物質的區分[J].江蘇大學學報：自然科學版，2008（1）：7-10.ZHAO Jie-wen，ZHANG Jian，ZOU Xiao-bo.Olfaction visualization technology and discriminance of five chemical compounds[J].Journal of Jiangsu University：Natural Science Edition，2008（1）：7-10.（in Chinese）

[10]趙杰文，鄒小波，黃星奕，等.基于氣體傳感器陣列技術的食品氣味快速無損檢測方法及裝置：中國03131660.3[P].2003-01-01.

[11]鄒小波，趙杰文，蔡健榮，等.兩種不同氣體傳感器陣列組合檢測氣味的方法和裝置：中國200710024696.1[P].2007-01-01.

[12]Di Natale Corrado，Paolesse Roberto，Macagnano Antonella，et al.Characterization and design of porphyrins based broad selectivity chemical sensors for electronic nose applications[J].Sensors and Actuators B：Chemical，1998，52（1-2）：162-168.

[13]LONG Jing，XU Jian-hua，XIA Shuang.Volatile organic compound colorimetric array based on zinc porphyrin and metalloporphyrin derivatives[J].Energy Procedia，2011（12）：625-631.

[14]黃星奕，周芳，蔣飛燕.基于嗅覺可視化技術的豬肉新鮮度等級評判[J].農業機械學報，2011，42（5）：142-145.HUANG Xing-yi，ZHOU Fang，JIANG Fei-yan.Evaluation of pork freshness using olfaction visualization detection technique[J].Transactions of the Chinese Society for Agricultural Machinery，2011，42（5）：142-145.（in Chinese）

[15]周芳.嗅覺可視化技術檢測豬肉新鮮度的研究[D].鎮江：江蘇大學，2011.

[16]Borch E，Kant-Muemansb M.Bacterial spoilage of meat products and cured meat[J].Food Microbiology，1996，33（1）：103-120.

[17]劉國慶，張黎利，宗凱，等.冷鮮豬肉貨架期品質測定及主要致腐微生物預報[J].食品科學，2009，30（18）：394-399.LIU Guo-qing，ZHANG Li-li，ZONG Kai，et al.Shelf-life properties of chilled pork and forecasting of main putrescence microorganisms[J].Food Science，2009，30（18）：394-399.（in Chinese）

[18]傅鵬，李平蘭.冷卻豬肉初始菌相分析與冷藏過程中的菌相變化規律研究[J].食品科學，2006，27（11）：119-124.FU Peng，LI Ping-lan.Study on the initial microflora and its changes of chilling pork meat[J].Food Science，2006，27（11）：119-124.（in Chinese）

[19]朱維軍，焦鐳，石閩生.冷卻豬肉中常見腐敗細菌的分離與鑒定[J].中國農學通報，2009，25（18）：99-101.ZHU Wei-jun，JIAO Lei，SHI Ming-sheng.Isolation and identification of common corrupt bacterium from chilled meat[J].Chinese Agricultural Science Bulletin，2009，25（18）：99-101.（in Chinese）

[20]Gill C O，Bryant J.The contamination of pork with spoilage bacteria during commercial dressing，chilling and cutting of pig carcasses[J].International Journal of Food Microbiology，1992，16（1）：51-62.

[21]GB/T 5009.44-2003.肉與肉制品衛生標準分析方法[S].北京：中國標準出版社，2003.

[22]海錚.基于電子鼻的牛肉新鮮度檢測[D].杭州：浙江大學，2006.