不同菌種以三七渣為基質的發酵過程

譚顯東， 段婭寧， 王君君， 羊依金

（成都信息工程學院 資源環境學院，四川 成都610225）

近年來，中成藥事業的快速發展導致中藥渣廢棄物排放量日益增加，2005年全國排放的中藥渣量已達3 000萬t[1]。如何合理地處置和利用中藥渣是實現中藥現代化進程中一個不可回避的重要問題。將中藥渣通過固態發酵技術轉化為蛋白飼料[2-7]可以有效地實現藥用植物生物量的全利用，在消除環境污染的同時還能為養殖業提供一種新型保健飼料，符合國家發展循環經濟的產業政策。

微生物固態發酵生物質原料生產蛋白飼料的關鍵在于選擇合適的菌種，目前常用的微生物有多糖分解菌和酵母菌這兩大類。由于微生物對營養物質的需求具有多樣性，再加上不同種類的廢棄生物質原料其組成和營養成分差異較大，因此采用固態發酵技術生產蛋白飼料的首要任務就是篩選出合適的微生物菌種。研究采用5種多糖分解菌和3種酵母菌為試驗菌種，通過菌體發酵過程研究，比較不同菌種對三七渣的利用情況，以此作為菌種選擇的依據。

1 材料與方法

1.1 菌種來源

本實驗所用的康寧木霉 3.2774（Trichoderma koningii 3.2774）、 綠 色 木 霉 （Trichoderma viride 3.3711）、白腐菌 5.776（Phanerochaete chrysosporium 5.776）、產朊假絲酵母（Candida utilis 2.281）:由四川大學建筑與環境學院保藏和提供；黑曲霉（Aspergillus niger）、米曲霉（Aspergillus oryzae）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）:由山東農業大學生命科學學院保藏和提供；熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）:由河北科技大學生物工程學院保藏和提供。

1.2 培養基

PDA培養基:在1.0 L馬鈴薯浸取液中加入20.0 g葡萄糖和15.0 g瓊脂，pH保持自然，在121℃滅菌30 min，用于康寧木霉、綠色木霉、白腐菌、黑曲霉、米曲霉的平板培養。

土豆汁液體培養基:在1.0 L土豆汁中加入20.0 g葡萄糖，pH保持自然，于121℃滅菌30 min，用于產朊假絲酵母、熱帶假絲酵母、釀酒酵母的液體培養。

三七渣固態發酵培養基:在10 g過60目篩的三七渣中加入0.4 g硫酸銨、0.04 g磷酸二氫鉀、0.005 g硫酸鎂、0.005 g氯化鈉，培養基含水量60%。于121℃滅菌30 min，用于各菌種生長代謝曲線實驗研究。

1.3 三七渣

三七渣:由四川省某中成藥廠提供，濕物料經烘干、粉碎、過40目篩后置于干燥器中備用。本次實驗所用藥渣中各主要成分質量分數如下:粗蛋白質12.28%，粗淀粉:33.13%，真蛋白9.97%，還原糖1.37%。若無特別說明，藥渣質量均以絕干物料計量。

1.4 實驗方法

1.4.1 種子液的制備 霉菌和白腐菌采用PDA平板培養基在30℃下于電熱恒溫恒濕培養箱內培養3～3.5 d后刮下，將其制成濃度為2×107個/mL的孢子懸液；酵母菌采用土豆汁液體培養基在30℃下于電熱恒溫培養箱內培養約16 h，制成濃度為2×107個/mL的菌懸液。

接種量定義如下:10 g三七渣培養基中接入1 mL該菌懸液，稱為10%的接種量，依此類推。

1.4.2 各菌種生長代謝曲線實驗 取若干個250 mL的錐形瓶，分別裝入10 g三七渣固態發酵培養基，121℃滅菌30 min以上，冷卻后，按照10%的接種量，分別接入10%的康寧木霉、綠色木霉、白腐菌、黑曲霉、米曲霉、產朊假絲酵母、熱帶假絲酵母和釀酒酵母，然后在30℃的恒溫恒濕培養箱中培養5 d，每隔12 h取樣分析一次，測定發酵培養物的干重、還原糖質量分數和pH值。發酵結束后測量發酵培養物中的粗蛋白和真蛋白質量分數。

1.5 分析方法

1.5.1 粗蛋白的測定 凱氏定氮法[8]。

1.5.2 真蛋白的測定 發酵樣品先進行醇洗預處理去除其中的無機氮[9]，再采用凱氏定氮法測定[8]。

1.5.3 淀粉的測定 酸水解法[10]。

1.5.4 還原糖的測定 3，5-二硝基水楊酸法[11]。

1.5.5 pH的測定 稱取1.0 g發酵培養物濕物料連同50 mL蒸餾水一起放入燒杯中，用磁力攪拌器攪拌5 min，然后靜置20 min，采用雷磁牌pH 3～3c精密pH計（上海精密科學儀器有限公司）測定上清液的pH值。

2 結果與討論

2.1 發酵培養物還原糖質量分數的動態變化

各菌種以三七渣為基質進行固態發酵時其發酵培養物中還原糖質量分數的動態變化曲線分別見圖1和圖2。

由圖1和圖2可以看出，多糖分解菌對三七渣的糖化能力明顯強于酵母菌。

圖1 多糖分解菌發酵培養物還原糖質量分數的動態變化Fig.1 Dynamic change of reducing sugar content in the fermentation culture（polysaccharide decomposition fungi）

圖2 酵母菌發酵培養物還原糖質量分數的動態變化Fig.2 Dynamic change of reducing sugar content in the fermentation culture（yeasts）

在整個發酵過程中，三七渣接種多糖分解菌進行發酵時，還原糖質量分數先升高后降低，變化幅度較大，采用黑曲霉發酵時峰值可以達到250 mg/g發酵培養物。微生物的新陳代謝活動包括分解代謝和合成代謝，在發酵前期，多糖分解菌分解代謝產生還原糖的速度大于其合成代謝消耗還原糖的速度，所以還原糖會不斷累積，質量分數逐漸升高，在發酵后期，由于菌體數量的增多，其對還原糖的利用速率越來越大，高于還原糖的生成速率，所以還原糖的質量分數會逐漸下降。采用根霉發酵生木薯渣時在發酵初期也觀察到與此類似的葡萄糖累積現象[12]。

三七渣接種酵母菌時，在0～12 h期間，發酵培養物干重有比較明顯的下降，還原糖質量分數由10 mg/g左右上升到30～40 mg/g，可能是酵母利用三七渣中殘存的少量還原糖進行代謝活動；在發酵12～96 h期間，隨著可利用碳源的減少，酵母菌代謝活動減弱，還原糖的產生和消耗速率基本達到平衡，還原糖質量分數幾乎沒有變化。但是當發酵進行96 h或108 h的時候，還原糖的質量分數第二次出現峰值（50～75 mg/g）后迅速下降，回落到先前的水平，這可能是由于某些具有誘導性的代謝物質累積到一定濃度，誘導酵母菌產生了轉化酶、丙酮酸脫羧酶、醇脫氫酶等[13]催化水解了前期發酵過程中產生的某些中間代謝產物，從而導致還原糖質量分數升高，這樣產生的少量還原糖被酵母利用后質量分數很快又恢復到先前的水平。而在采用產朊假絲酵母發酵蘋果渣生產營養富集基質的研究中，還原糖只隨發酵時間的延長而逐漸下降，沒有觀察到還原糖的累積現象[14]。

2.2 發酵培養物干重的動態變化

各菌種以三七渣為基質進行固態發酵時其發酵培養物干重的動態變化曲線分別見圖3和圖4。

圖3 多糖分解菌發酵培養物干重的動態變化Fig.3 Dynamic change of dry weight of fermentation culture（polysaccharide decomposition fungi）

圖4 酵母菌發酵培養物干重的動態變化Fig.4 Dynamic change of dry weight in the fermentation culture（yeasts）

由圖3和圖4可以看出，多糖分解菌發酵培養物的干重變化幅度遠遠大于酵母菌。在所有受試菌種中，發酵培養物干重變化幅度最大的是黑曲霉，到發酵結束時，其干重小于6.0 g；酵母菌發酵培養物的干重變化較小（最大失重不超過1.0 g）。發酵培養物干重變化幅度越大，說明微生物的代謝活動越強烈，發酵過程中釋放的二氧化碳越多。造成這兩類菌體的代謝活動產生較大差異的原因在于:多糖分解菌能夠大量分泌各種淀粉酶或纖維素酶，用于水解三七渣中的多糖類大分子物質并生成還原糖供其自身利用，呼吸作用很強烈；而酵母菌不能大量產生這些酶類，就只能利用三七渣中殘存的少量低碳糖，因此代謝過程自然就不如多糖分解菌活躍。

2.3 發酵培養物pH的動態變化

各菌種以三七渣為基質進行固態發酵時其發酵培養物pH的動態變化曲線分別見圖5和圖6。

圖5 多糖分解菌發酵培養物pH的動態變化Fig.5 Dynamic change of the fermentation culture pH（polysaccharide decomposition fungi）

圖6 酵母菌發酵培養物pH的動態變化Fig.6 Dynamic change of the fermentation culture pH（yeasts）

由圖5和圖6可以看出，與酵母菌相比，多糖分解菌在三七渣上培養時發酵培養物的pH變化較大，尤其是黑曲霉發酵三七渣的時候，pH下降得最快，在發酵36 h后基質的pH由4.7下降到3.8。由于微生物在對多糖類物質進行代謝過程中會產生各種有機酸，因此發酵培養物的pH會發生變化，pH的變化幅度也間接反映了發酵過程中微生物代謝活動的強弱。實際上，采用同一種多糖分解菌，針對不同的基質進行固態發酵，在發酵過程中基質pH變化趨勢也有所不同，這取決于基質是否容易被微生物分解利用。例如，采用黑曲霉（Aspergillus niger）發酵棕櫚仁餅[15]、稻糠、小麥麩皮和落花生飼草時，pH變化趨勢與圖5相似，但是，采用鋸木屑為基質時，發酵過程中pH變化幅度就很小[16]。

2.4 發酵培養物的真蛋白質量分數

經過5 d的發酵后，不同菌種發酵培養物中真蛋白質量分數排序如下:

黑曲霉 （23.92%）＞白腐菌 （20.44%）＞米曲霉（19.56%）＞綠色木霉（18.38%）＞康寧木霉（17.88%）＞產朊假絲酵母＞（10.79%）熱帶假絲酵母（9.98%）＞釀酒酵母（9.35%）。

由此可以看出，在經歷5 d的發酵后，不同受試菌種的發酵培養物中真蛋白質量分數差異較大，多糖分解菌的發酵培養物中真蛋白質量分數遠遠高于酵母菌，這與圖1～6中所反映出的不同菌種對三七渣的代謝能力差異相一致。在所有受試菌種中，黑曲霉對三七渣的代謝能力最強，發酵結束時其發酵培養物中真蛋白質量分數最高。

3 結語

在本次試驗條件下，通過不同菌種以三七渣為基質的發酵過程研究，可以得到如下結論:

1）多糖分解菌對三七渣的代謝能力明顯強于酵母菌。在發酵過程中多糖分解菌發酵培養物的還原糖質量分數、干重、pH值變化幅度均大于酵母菌。

2）在所有受試菌種中黑曲霉對三七渣的代謝能力最強，其發酵培養物中還原糖質量分數峰值可達250 mg/g，發酵結束時其發酵培養物干基減重率達42.6%，發酵培養物中真蛋白質量分數可以達到23.92%。

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